[发明专利]一种基于肿瘤新生抗原的T细胞分选制备技术及其应用

说明书

本发明公开了分子生物学技术领域的一种基于肿瘤新生抗原的T细胞分选制备技术及其应用，该种基于肿瘤新生抗原的T细胞分选制备技术及其应用，包括以下步骤，S1：采集肿瘤标本，基因测序分析肿瘤基因突变，通过手术、穿刺、介入等手段采集患者肿瘤组织；通过全外显子测序、探针回收法测序等方法测序检测基因突变，S2：根据基因突变分析肿瘤新生抗原，根据基因突变、HLA亲和力、基因表达等信息分析肿瘤新生抗原，该种基于肿瘤新生抗原的T细胞分选制备技术及其应用，采用细胞分选技术，基于肿瘤新生抗原将NRT细胞分选出来，获得纯的NRT细胞，为后续的细胞治疗从安全性、成本、有效性方面做准备。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体为一种基于肿瘤新生抗原的T细胞分选制备技术及其应用。

背景技术

目前，肿瘤治疗临床上以手术、放疗、化疗为主的综合治疗效果并不理想。近年来分子靶向治疗的广泛应用虽显著改善了晚期肿瘤患者的生存质量，但靶向治疗主要针对有突变的人群，其获益人群少且最终均面临耐药性的问题。肿瘤免疫治疗是近年来肿瘤治疗领域的研究热点。2013年，肿瘤的免疫治疗被《Science》杂志评为年度十大科学突破之首。2016年，美国临床肿瘤学会(ASCO)宣布免疫治疗为年度肿瘤研究的首要进展。随着肿瘤免疫治疗在基础和临床实践中均取得引人瞩目的成果，越来越多的的权威文献指出，基于患者自身的肿瘤基因组变异信息，建立以新抗原为基础的个体化免疫治疗模式是未来免疫治疗的重要发展方向，有着治愈性的潜力，尤其在实体瘤中更具优势。这一通过高通量测序及大数据分析，利用生物信息学，筛选出针对癌细胞基因突变产生的特异性新抗原进行精准生物免疫治疗的策略，是新一代免疫治疗的发展方向，有望克服以靶向药物为核心的传统肿瘤精准医疗模式的缺陷，是精准医疗新时代的突破口。

新生抗原相关的免疫疗法是一种真正的个性化疗法，截至2019年5月，在ClinicalTrail上新生抗原肿瘤疫苗临床试验有44项之多,研究包括黑色素癌、肺癌、胶质母细胞瘤、胰腺癌等17个癌种。基于新生抗原疫苗的临床研究在2018年出现历史性的年度同比增长,达到900%；更可观的是，2019年第一季度，仅这一个季度同比增长达350%。由于技术壁垒较高以及疗效不明确，这种靶向肿瘤新生抗原的个性化疫苗在成为主流之前仍存在巨大挑战。

肿瘤难以根治的很重要原因在于肿瘤的异质性、而肿瘤异质性的根本原因在于基因突变，因此基于肿瘤新生抗原的T细胞治疗有望为肿瘤的免疫治疗带来新的希望，NRT细胞治疗相比其他免疫细胞治疗的优势在于：肿瘤免疫细胞治疗主要包括树突状细胞/细胞因子诱导的杀伤细胞（DC-CIK）和过继性细胞治疗（ACT）等。近期进展在过继性细胞治疗中有较多体现，除了嵌合抗原受体-T细胞（CAR-T）治疗之外，T细胞受体嵌合型T细胞（TCR-T）治疗、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）治疗和新生抗原反应性T细胞（NRT）治疗等在实体瘤方面也有所突破。Car-T是现在肿瘤细胞免疫治疗的热点，虽然Car-T在血液肿瘤中取得了巨大的成功，但是由于缺乏合适的靶点，Car-T在实体肿瘤中进展缓慢。目前，针对NY-ESO-1、MAGE-A3两种靶点的TCR-T技术在晚期软组织肿瘤的应用中已经初步积累了有效性数据。

受限于TCR-T技术的开发过程过于复杂，与患者免疫系统兼容性较差，临床实用灵活性较差等原因，因此TCR-T进展一直很缓慢。TIL疗法已经在多种类型实体瘤中展示了出色的临床治疗结果，TIL技术的应用受限于多数患者TIL细胞的获取不易，细胞回输后在体内活性持续较短疗效欠佳等原因，和上面几种肿瘤免疫细胞治疗方式相比，NRT细胞由于基于肿瘤新生抗原，因此具备靶向性特异、靶向多样以及容易制备等特点，是精准免疫治疗的典范。

但是NRT细胞制备过程中纯度不够影响治疗效果，比如以往采用DC-CIK模式制备的NRT细胞由于细胞是一种混合物，里面含有NRT细胞也包含其他细胞比如Treg细胞，DC细胞等，这些细胞一方面为治疗的安全性带来不确定因素，所获细胞不纯，另一方面增加细胞制备的成本，还有就是影响治疗的效果，因此如何分型纯化NRT细胞就显得尤为重要。

发明内容