[发明专利]一种无动物源性脐带间充质干细胞的培养方法

权利要求书

1.一种无动物源性脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于所述工艺包括以下培养步骤：

一、包被基质胶：

1）包被比例：

原代制备包被比例：1：50，每个T75培养瓶加100ulstemcell基质胶（#07130）；4.9 mlPBS；

P1、P2传代包被比例：1：75；

2）包被时间:

轻柔混匀后15-25℃包被时间大于2小时，使用前倒掉基质胶，用PBS或生理盐水轻柔冲次一次；

二、脐带的选择和处理：

1）新鲜健康脐带，取1cm长，用75%酒精冲洗一次，0.9%氯化钠注射液冲洗两次去除残留血液；沿脐静脉剪开脐带，用止血钳及剪刀剔去1根脐静脉、2根脐动脉，用0.9%氯化钠注射液浸洗两次,用剪刀剪碎成1mm³大小组织块，应用5ml浓度为2mg/L索莱宝胶原酶消化组织后应用BD公司流式细胞仪检测，CD105表达大于95%认定为合格脐带，进行下一步制备；

2）经检测合格的脐带，取5cm长短，同上处理为碎成1mm³大小组织块，用stem cell干细胞完全培养液悬浮组织块，平均分配到T75培养瓶中；（T75培养瓶终体积12ml） ；

6）将培养瓶放入37℃、5%二氧化碳培养箱中；

三、培养5天进行半量换液，取出5ml培养液，加入5ml预温的培养液，避免碰到贴壁组织块；

四、培养10天进行全量换液，加入12ml预温的培养液，避免碰到贴壁组织块；

五、14天处理原代细胞；

细胞传代：

1）包被基质胶：每个T75培养瓶加5 ml PBS，67 ulstemcell基质胶（#07130）；

2）收集原代培养液及组织块，用生理盐水浸洗2次T75培养瓶后，加入3ml stemcell酶解液（#05427），37℃ 孵育2-3分钟，加入3ml 酶抑制液（#05428），加入10ml完全培养液浸洗细胞，收集至50ml离心管，离心285g，10分钟；

3）加入20mlstem cell干细胞完全培养液，轻柔混匀后计数细胞，调整细胞浓度为：T75cm2 1-1.5*105/瓶，终体积10-12ml；

六、干细胞的冻存：

干细胞消化清洗步骤同上，计数细胞，台盼蓝染色计数活率，离心清洗后应用BD公司的流式细胞仪（FACSVia）测量表型，表型合格细胞用stemcell CS10冻存液(#07959)悬浮细胞，调整细胞浓度为5-10×106/ml，标记冻存管；

使用Thermo程序降温仪7451对细胞进行程序降温后储存于Thermo液氮高效液氮储存罐（20782183）的摄氏-196度的气相中。

2.如权利要求1所述的脐带间充质干细胞培养方法，其特点在于正式培养前对脐带进行选择，提高制备合格率，减少制备成本。

3.步骤二中冻存的脐带间充质干细胞建立供者健康信息资料数据库、干细胞资料库，配条形码。

4.如权利要求1所述的脐带间充质干细胞培养方法，其特征在于无动物源性，收集的细胞包括P2及P3。

5.如权利要求1所述的脐带间充质干细胞培养方法，其特征在于应用程序降温仪，提高细胞复苏率。

6.如权利要求1所述的脐带间充质干细胞培养方法，其特征在于所有操作均处于GMP实验中中进行。