[发明专利]一种无动物源性脐带间充质干细胞的培养方法

说明书

本发明涉及医疗领域，针对现有间充质干细胞培养方法的不足，提供了一种无动物源性脐带间充质干细胞的培养方法。本发明脐带间充质干细胞培养方法的构建包括：1、包被基质胶。2、脐带组织分离。3、换液。4、处理原代细胞，细胞传代。5、细胞冻存。

技术领域

本发明涉及医疗领域，特别提供一种脐带间充质干细胞的培养方法。

背景技术

近年来随着生命科学与医学的快速发展，国内外创新性生物治疗技术进展迅速，细胞治疗已发展成为药物治疗和手术治疗后的第三次医疗革命，在恶性肿瘤、炎症、自身免疫性疾病、抗衰老、再生医学等多个领域显示出巨大的应用潜力。细胞治疗包括免疫细胞治疗和干细胞治疗，干细胞治疗包括胚胎干细胞（ESC）、组织特异性前体干细胞（TSPSC）、间充质干细胞（MSC）、脐带干细胞（UCSC）、骨髓干细胞（BMSC）和诱导多潜能干细胞（iPSC）等。目前，干细胞在重大慢性疾病、严重创伤修复的再生医学领域，已经成为弥补传统治疗不可或缺的有效手段。

间充质干细胞（MSC）因在特定环境下可分化为软骨、骨、支付和肌肉等间质而得名。广泛存在于脐带、胎盘、脂肪、肺、心脏及骨髓等组织中。其特点包括贴壁生长，表达细胞表面标志CD105、CD73、CD90，低表达CD45、CD34、CD14、CD79、CD19及HLA-DR。既往传统的细胞生物学制备方法，制备出的干细胞因细胞表型不合格被器用，浪费了大量的人力物力，本发明一定程度上解决了该问题。

本发明公开用于临床研究所用的、安全可靠的脐带间充质干细胞制备及储存方法。

发明内容

为了提供一种高效新型的脐带间充质干细胞培养方法，本发明采用如下的技术方案：

一、基质胶包被T75培养瓶：

1）包被比例：

原代制备包被比例：1：50，每个T75培养瓶加100ul stemcell基质胶（#07130）；4.9 mlPBS；P1、P2传代包被比例：1：75，每个T75培养瓶加5.92 ml PBS，80 ul基质胶（#07130）；PBS为不含镁和钙离子溶液。

2）包被时间:

轻柔混匀后15-25℃包被时间大于2小时，使用前倒掉基质胶，用PBS或生理盐水轻柔冲次一次；

二、脐带的选择和处理：

1）新鲜健康脐带，取1cm长，用75%酒精冲洗一次，0.9%氯化钠注射液浸洗两次去除肉眼可见的污物及残留血液；沿脐静脉剪开脐带，用止血钳及剪刀剔去1根脐静脉、2根脐动脉，用0.9%氯化钠注射液浸洗两次,用剪刀剪碎成1mm³大小组织块，应用5ml浓度为2mg/L索莱宝胶原酶消化组织后应用BD公司流式细胞仪检测，细胞表型CD105表达大于95%认定为合格脐带，进行下一步制备；

2）经检测合格的脐带，取5cm长短，同上述处理方法处理为碎成1mm³大小组织块，用stem cell干细胞完全培养液悬浮组织块，平均分配到T75培养瓶中；（T75培养瓶终体积12ml）；

6）将培养瓶放入37℃、5%二氧化碳培养箱中培养；

三、培养第5天进行半量换液，取出5ml培养液，加入5ml预温的培养液，避免碰到贴壁组织块；

四、培养第10天进行全量换液，加入12ml预温的培养液，避免碰到贴壁组织块；

五、14天处理原代细胞。PO细胞传代P1：

1）包被基质胶：每个T75培养瓶加5 ml PBS，67 ulstemcell基质胶（#07130）；

2）收集原代培养液及组织块，用生理盐水清洗2次T75培养瓶后，加入3ml stemcell酶解液（#05427），37℃孵育2-3分钟，加入3ml 酶抑制液（#05428），加入10ml完全培养液冲洗细胞，收集至50ml离心管，离心285g，10分钟；