[发明专利]一种在昆虫细胞中共表达非洲猪瘟病毒四种结构蛋白的方法及其应用

权利要求书

1.一种重组穿梭质粒pF4-pp62-p54-p30-p72，其特征在于，所述重组穿梭质粒是将非洲猪瘟病毒四种结构蛋白pp62、p54、p30和p72基因插入到重组穿梭质粒pF4中；所述pp62基因插入pF4多克隆位点MCS3的酶切位点Sph I和Xho I之间；p54基因插入表达载体pF4多克隆位点MCS1的酶切位点Sbf I和Nhe I之间；p30基因插入表达载体pF4多克隆位点MCS2的酶切位点Aat II和Eco81 I之间；p72基因插入表达载体pF4多克隆位点MCS4的酶切位点BamHI和EcoR I之间；所述重组穿梭质粒pF4基因序列如SEQ ID NO.6所示；所述的重组穿梭质粒pF4-pp62-p54-p30-p72，其特征在于，所述pp62、p54、p30和p72基因序列分别如SEQ IDNO.2-5所示。

2.一种重组病毒，其特征在于，包含权利要求1所述重组穿梭质粒pF4-pp62-p54-p30-p72。

3.权利要求2所述的重组病毒，其特征在于，所述重组病毒为重组杆状病毒rBac-pp62-p54-p30-p72。

4.权利要求1所述重组穿梭质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1）限制性内切酶Bsp1407 和SnaB 对质粒pUC–F4和载体pFastBac-Dual进行双酶切，切胶回收纯化获得线性的F4和pFastBac-Dual；通过连接、转化、PCR和双酶切技术获得重组穿梭质粒pF4；

2）限制性内切酶Sbf I和Nhe I对质粒pUC–pp62和重组穿梭质粒pF4进行双酶切，胶回收纯化酶切产物，获得线性的pp62和pF4；通过连接、转化、PCR和双酶切技术获得重组穿梭质粒pF4-pp62；

3）限制性内切酶Sph I和Xho I对质粒pUC–p54和重组穿梭质粒pF4-pp62进行双酶切，胶回收纯化酶切产物，获得线性的p54和pF4-pp62；通过连接、转化、PCR和双酶切技术获得重组穿梭质粒pF4-pp62-p54；

4）限制性内切酶Aat II和Eco81I对质粒pUC–p30和重组穿梭质粒pF4-pp62-p54进行双酶切，胶回收纯化获得线性的p30和pF4-pp62-p54；通过连接、转化、PCR和双酶切技术获得重组穿梭质粒pF4-pp62-p54-p30；

5）限制性内切酶BamH I和EcoR I对质粒pUC–p72和重组穿梭质粒pF4-pp62-p54-p30进行双酶切，切胶获得线性的p72和pF4-pp62-p54-p30；通过连接、转化、PCR和双酶切技术获得重组穿梭质粒pF4-pp62-p54-p30-p 72。

5.权利要求3所述重组病毒的制备方法，其特征在于，所述方法包括权利要求4所述方法，并进一步包括如下步骤：

6）将重组穿梭质粒pF4-pp62-p54-p30-p 72热激转化入感受态细胞DH10Bac，通过菌落PCR筛选出转座成功的重组杆粒；通过脂质体转染昆虫细胞Sf9，获得重组杆状病毒rBac-pp62-p54-p30-p 72。

6.一种在昆虫细胞中同时表达非洲猪瘟病毒四种结构蛋白pp62、p54、p30和p72重组蛋白的方法，其特征在于，所述方法利用权利要求2-3任一所述的重组病毒感染昆虫细胞Sf9后共表达非洲猪瘟病毒pp62、p54、p30和p72四种重组蛋白，并进一步包含蛋白纯化步骤。

7.权利要求6所述的在昆虫细胞中同时表达非洲猪瘟病毒四种结构蛋白pp62、p54、p30和p72重组蛋白的方法，其特征在于，所述具体步骤包括：

1）将权利要求2-3任一所述的重组病毒接种至Sf9细胞，28℃培养72 h；

2）待80% Sf9细胞出现细胞病变，加入RIPA裂解液裂解细胞；

3）4℃，10000 r/min离心10min，离心后采用Ni亲和层析柱纯化上清中的目的蛋白，获得纯化的非洲猪瘟病毒pp62、p30、p54和p72重组蛋白。

8.权利要求1所述的重组穿梭质粒或权利要求2-3任一所述的重组病毒在共表达非洲猪瘟病毒pp62、p30、p54和p72中的应用。