[发明专利]一种在昆虫细胞中共表达非洲猪瘟病毒四种结构蛋白的方法及其应用

说明书

本申请涉及一种在昆虫细胞中共表达非洲猪瘟病毒四种结构蛋白的方法及其应用。本发明将非洲猪瘟病毒四种结构蛋白pp62、p54、p30和p72基因插入经改造pFastBac‑Dual后获得的穿梭载体，制备重组穿梭质粒pF4‑pp62‑p54‑p30‑p72，并获得重组杆状病毒rBac‑pp62‑p54‑p30‑p72，实现昆虫细胞中的高效共表达。基于共表达的混合重组蛋白建立用于检测非洲猪瘟抗体的间接ELISA方法，具有敏感性高、特异性高和重复性好等优点。

技术领域

本申请涉及分子生物学和生物技术领域，具体涉及一种同时表达非洲猪瘟病毒四种结构蛋白pp62、p30、p54和p72的昆虫杆状病毒表达系统及其应用。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine FeverVirus，ASFV)感染引起的猪的一种烈性、高度接触性传染病。其急性症状以高热、网状内皮系统出血及高死亡率为特征。家猪和野猪所有品种及各年龄段均易感。钝缘蜱属软蜱，特别是O.moubata和O.erraticus是非洲猪瘟病毒的贮存媒介和传播媒介。此前该病仅限于非洲发生，直到上世纪中叶传到欧洲、南美及加勒比海地区，2007年传入东欧并逐渐蔓延至俄罗斯西伯利亚地区。2018年8月3日，我国确诊首例非洲猪瘟疫情，随后该病在全国大范围爆发，并给我国养猪业带来巨大损害。

非洲猪瘟病毒属于DNA病毒，病毒粒子呈正二十面体结构。其基因组DNA包含151～167个开放阅读框，约编码68种结构蛋白和100多种非结构蛋白。其中，pp62、p54、p30和p72四种蛋白为非洲猪瘟病毒重要的结构蛋白，在非洲猪瘟病毒的组装和侵染宿主细胞中有着极其重要的作用，也是目前非洲猪瘟病毒致病机制、疫苗研制以及检测方法的主要靶蛋白。

目前，虽然现有技术中有对于上述四种蛋白的分别表达或个别进行部分共表达，但至今未见有在昆虫细胞中同时共表达非洲猪瘟病毒pp62、p54、p30和p72四种蛋白的方法和体系。而鉴于非洲猪瘟病毒属于高致病烈性猪传染病病毒，我国法定一类传染病病毒，按照生物安全管理要求，除农村农业部认可的实验室外，其他实验室不得操作涉及非洲猪瘟病毒分离等实验。因此，寻求多种结构蛋白一次性共表达作为病毒替代，能够为在无法进行非洲猪瘟病毒操作的情况下提供了一种制备其高效抗原的新的研究途径和方法，具有极其重要意义。

鉴于此，提出本发明。

发明内容

本申请的目的之一是提供了一种含pF4-pp62-p54-p30-p72的重组杆状病毒的构建方法，用该重组杆状病毒感染昆虫细胞Sf9后可同时表达非洲猪瘟病毒pp62、p30、p54和p72四种结构蛋白；

本申请的目的之二是提供了一种应用，利用重组杆状病毒同时表达来制备pp62、p30、p54和p72四种重组蛋白；

本申请的目的之三是提供了一种间接ELISA方法，以共表达的pp62、p30、p54和p72四种混合重组蛋白为包被抗原，建立了一种用于非洲猪瘟抗体检测的间接ELISA方法；

为实现上述目的，本发明提供了一种重组穿梭质粒pF4，其具有4个多克隆位点；

在一些实施方式中，所述质粒pF4为载体pFastBac-Dual的第3510位碱基与第3985位碱基之间的序列被F4序列代替，从而具有4个含有独立启动子的多克隆位点MCS1、MCS2、MCS3、MCS4。

在一些优选的实施方式中，所述F4的基因序列如SEQ ID NO.1所示；优选的，所述重组穿梭质粒pF4的基因序列如SEQ ID NO.6所示。

本申请还提供了一种插入了非洲猪瘟病毒四种结构蛋白pp62、p30、p54和p72基因的重组穿梭质粒的pF4-pp62-p54-p30-p72，所述质粒是将非洲猪瘟病毒四种结构蛋白pp62、p54、p30和p72基因插入所述的重组穿梭质粒pF4中。