[发明专利]黄花蒿细胞生物转化二氢去氧青蒿素B的方法和用途

说明书

本发明是黄花蒿细胞生物转化二氢去氧青蒿素B的方法和用途。涉及到黄花蒿脱分化细胞的诱导、悬浮培养，利用TLC、HPLC‑ELSD和GC‑MS法考察并优化二氢去氧青蒿素B最佳转化时间和最佳转化浓度。光照培养条件下，最佳转化条件为60h和90mg/L；暗培养条件下，最佳转化条件为72h和90mg/L。进一步积累转化产物，利用硅胶柱、Sephadex LH‑20及半制备液相进行分离纯化后得到三个化合物，通过HR‑ESI‑MS、NMR进行结构鉴定，确定为3α‑hydroxy dihydro‑epi‑deoxyarteannuin B，9β‑hydroxy dihydro‑epi‑deoxyarteannuin B和14‑hydroxy dihydro‑epi‑deoxyarteannuin B；细胞冻干、乙酸乙酯超声提取以及GC‑MS检测青蒿素的含量，光照培养和暗培养条件下，实验组的青蒿素含量分别增加了3.6％和23.9％。利用qRT‑PCR法检测最佳转化条件下黄花蒿细胞中HMGR、FPS、ADS、CYP71AV1、CPR、DBR2和ALDH1的表达水平。

技术领域

本发明属于药物化学中的天然活性产物的生物转化领域，具体涉及到黄花蒿脱分化细胞的诱导、固体培养及液体悬浮培养，考察并优化二氢去氧青蒿素B最佳转化时间和最佳转化浓度；转化产物的积累、分离纯化以及通过HR-ESI-MS、¹H-NMR、¹³C-NMR进行结构鉴定；黄花蒿细胞冻干、乙酸乙酯超声提取及GC-MS检测青蒿素含量；qRT-PCR法检测最佳转化条件下黄花蒿细胞中基因的表达水平。

背景技术

青蒿素是我国科学家于1971年从中药黄花蒿Artemisia annua L.中分离出来的一种具有过氧桥的倍半萜类化合物，它具有抗疟疾等多种生物活性。目前，以青蒿素类药物为主的联合疗法已经成为世界卫生组织推荐的抗疟疾标准疗法。由于青蒿素在植物中含量低 (0.02％～1.07％)，且具有地区差异性，因此其原料药产量远远不能满足患者的需求。目前，青蒿素的获取途径包括直接从黄花蒿提取，化学合成和生物合成。

国内药用青蒿素主要从黄花蒿提取获得，黄花蒿的种植采收以及加工步骤繁琐，而且费时费力，占地面积大等缺点给其商业化生产带来挑战。青蒿素的化学合成在20世纪80年代就已实现。化学合成的成本低廉，并且该反应可以放大到数十克，但合成路线复杂，产率较低，并且生产过程对环境造成较大污染，废液处理成本高。青蒿素的半合成主要采用生物合成青蒿酸，再以青蒿酸为原料化学合成青蒿素。该方法收率高，操作简便，有望实现大规模工业化生产。但半合成依赖于对青蒿素衍生物的获取，工业生产成本较高。迄今为止，通过酵母工程菌发酵生产青蒿酸，再以青蒿酸为原料合成青蒿素被广泛应用。生物全合成因其操作简便，成本低廉而备受青睐，因此具有诱人的前景。青蒿素生物全合成具有巨大的应用价值，但是由于其生物合成终端反应机理不明确，因此目前尚无法实现。

将外源性的有机化合物添加到处于生长状态的生物体系或酶体系中，底物在生物系统中酶的催化作用下发生化学结构的变化，该过程称为生物转化。生物转化反应具有选择性强、条件温和以及环境友好等优点。一般用于转化研究的生物体系主要有细菌、真菌、藻类、植物悬浮细胞和组织等，其中应用最多的是植物悬浮细胞。这些转化产物一般很难通过化学反应实现。

悬浮细胞的生物转化一般用于天然产物和有机合成产物的结构修饰，进而获得先导化合物。利用生物转化法获得到其衍生物再进一步研究，有望解决这些问题。利用植物悬浮培养细胞进行生物转化反应与化学反应等方式具有显著的差别及优势。该方法操作简单，环境友好，适合大规模生产。但是植物细胞在培养过程中生长缓慢，容易受到环境如温度等的影响，并且需要在无菌环境下操作，这些缺点限制了植物悬浮细胞的利用。

前期研究表明，二氢去氧青蒿素B可能是青蒿素的前体，因此可以促进青蒿素及其转化产物含量的提高。本研究通过向黄花蒿悬浮细胞中饲喂二氢去氧青蒿素B来实现。

发明内容

本发明的目的在于研究向黄花蒿悬浮细胞饲喂二氢去氧青蒿素B来提高转化产物和青蒿素含量的方法。