[发明专利]核酸的检测方法

说明书

本发明涉及通过逆转录‑聚合酶链反应(reverse transcription‑polymerase chain reaction，RT‑PCR)检测被检体中的RNA病毒的方法及用于执行该方法的试剂盒。更具体而言，涉及具有以下特征的检查方法及用于执行该方法的试剂盒：即，用于与被检体混合并得到作为分析试样的离心上清液的纯化水、生理盐水或缓冲液预先包含选自内参DNA、和与该DNA特异性地杂交的正向及反向引物中的至少一个要素，另一方面，RT‑PCR反应液不包含所述纯化水、生理盐水或缓冲液中包含的所述要素。

技术领域

本发明涉及通过逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerasechain reaction，RT-PCR)检测被检体中的RNA病毒的方法及用于执行该方法的试剂盒。更具体而言，涉及具有以下特征的检查方法及用于执行该方法的试剂盒：用于与被检体混合并得到作为分析试样的离心上清液的纯化水、生理盐水或缓冲液预先包含选自内参DNA、与该DNA特异性地杂交的正向及反向引物中的至少一个要素，另一方面，RT-PCR反应液不包含所述纯化水、生理盐水或缓冲液中包含的所述要素。

背景技术

为了防止细菌或病毒造成的感染及防止感染的扩大，确定细菌或病毒的感染者、细菌或病毒的污染物至关重要。作为该污染物，可以例举感染者的粪便、吐出物及被这些直接或间接地污染的物品类、以及被细菌或病毒污染的食品类等。

在细菌或病毒的检测法中有各种方法，作为迅速测量的方法，普及有基于PCR法的核酸检测法。例如，作为迅速地以高灵敏度测量作为RNA病毒的诺如病毒的方式，可以例举通过RT-PCR扩增诺如病毒的RNA，测量扩增产物量的方法(专利文献1、2，非专利文献1)。在日本国内，根据厚生劳动省医药食品局食品安全部监视安全课的通知(非专利文献2、3)，广泛地进行基于RT-PCR法的诺如病毒的检测及基于实时PCR法的诺如病毒的定量检测，还市售有诺如病毒检测试剂盒。

在作为微生物的细菌或病毒污染的检查对象为粪便等排泄物的情况下，通常将粪便悬浮在纯化水或生理盐水等中而得的粪便乳剂高速离心分离，并将得到的离心上清液作为被检体，通过PCR或RT-PCR进行源自微生物的基因的分析。通常，在市售的核酸检查用试剂盒中包含内参DNA，通过添加到PCR反应系统中，可以用作用于判断核酸的检测是否恰当地进行即判断PCR反应是否恰当地进行的指标。其结果为，即便在没有检测出相对于源自被检体中的微生物的核酸的扩增曲线或扩增产物的熔解曲线峰的情况下，在检测到内参DNA的扩增曲线或扩增产物的熔解曲线峰时，也对微生物污染判定为真阴性。此外，若因源自被检体的成分而阻碍PCR反应，则虽然未检测到源自被检体中的微生物的核酸，但只要内参DNA共存，内参DNA也不会被检测出，因此能够避免被检体的微生物污染被误判定为阴性的情况(假阴性)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2002/029119

专利文献2：WO2002/029120

非专利文献

非专利文献1：Kageyama T等，《Broadly reactive and highly sensitive assayfor Norwalk-like viruses based on real-time quantitative reversetranscription-PCR(基于实时定量逆转录PCR对诺瓦克样病毒的广泛反应性与高灵敏度测量)》，临床微生物学杂志2003年4月；41(4)：1548-57。

非专利文献2：日本厚生劳动省医药食品局食品安全部监视安全课食安监发布第1105001号(平成15年11月5日)附件《关于诺如病毒的检测法》，最终修订：食安监发布0514004号(平成19年5月14日)