[发明专利]新城疫病毒感染HeLa细胞产生的外泌体纯化和检测方法

说明书

本发明属于生物检测方法领域，涉及新城疫病毒(NDV)感染子宫颈癌细胞系HeLa细胞后所产生的外泌体(exosome)的纯化和检测方法。本发明的exosome纯化方法，依次包括下列步骤：(1)将含有待测exosome的细胞上清液以10000g‑12000g的速度离心20‑35min；(2)取上清以135000g‑145000g的速度离心90‑100min。本发明的检测方法包括：透射电子显微镜确定exosome形态；exosome表面标志性蛋白CD63的确定；exosome大小、浓度分析。本发明可用于纯化和检测NDV感染HeLa细胞后产生exosome，为研究exosome在病毒感染中的作用奠定基础。

技术领域

本发明属于生物检测方法领域，具体地说，本发明涉及NDV(Newcastle diseasevirus,NDV)感染宫颈癌细胞系HeLa细胞后的外泌体(exosome)纯化和检测方法。

背景技术

新城疫病毒(NDV)是ssRNA病毒，有包膜。病毒颗粒具多形性，有圆形、椭圆形和长杆状等。成熟的病毒粒子直径100～400nm。包膜为双层结构膜，由宿主细胞外膜的脂类与病毒糖蛋白结合衍生而来。包膜表面有长12～15nm的刺突，具有血凝素、神经氨酸酶和溶血素。病毒的中心是ssRNA分子与附在其上的蛋白质衣壳粒，缠绕成螺旋对称的核衣壳，直径约18nm。成熟的病毒是以出芽方式释放至细胞外。

NDV对外界环境的抵抗力较强，55℃作用45min和直射阳光下作用30min才被灭活。病毒在4℃中存放几周，在-20℃中存放几个月或在-70℃中存放几年，其感染力均不受影响。在新城疫暴发后8周之内，仍可在鸡舍、蛋巢、蛋壳和羽毛中分离到病毒。

人类可以被NDV所感染，最普遍的是在感染后24小时内出现结膜炎症状。1942年首次报道的病例，患者出现耳前及周围淋巴结肿胀，手触柔软。在最初被感染的48小时，患者普遍会出现头痛，不适和轻度的冷战，症状可以持续24小时。采取局部治疗，可缓解结膜炎症状，且患者在1周内可以恢复视力。自感染后2周，血清学检测呈阳性感染者的泪液中仍可以分离到病毒。之后报道的人感染新城疫的症状是相类似的，均会常常出现眼部症状，有时是一只眼部出现变化，偶尔是双眼，并伴随有眼皮水肿、结膜充血、流泪和疼痛等。极少会出现发热、颤抖、头痛、咽炎和畏光等。

Exosome是一类由细胞分泌直径约为30-120nm的小囊泡，在电镜下呈现典型的“茶杯托”结构。1983年，Harding等在绵羊网织红细胞培养上清中首次发现了这类小囊泡。1986年，John Stone等将这些囊泡命名为“Exosome”，中文名译为“外泌体”，因其似乎能进行“反内吞”作用。在exosome发现的最初几年，一直被认为是细胞用来运输废弃蛋白的“垃圾车”。众所周知，主要组织相容性复合体-II(major histocompatibility complex，MHC II)分子对于适应性免疫或不可缺。而1996年，Raposo等在EB病毒(Epstein-barr virus，EBV)转化的B淋巴细胞exosome内发现了MHC II分子，从而揭开了exosome另一层潜藏的身份，即另一种细胞间通讯方式，因其将携带的信号分子传递至邻近或距离较远的细胞组织，影响多个细胞生命活动过程。