[发明专利]一种酶催化的（1S,5R）-双环内酯的合成方法

权利要求书

1.一种酶催化的（1S，5R）-双环内酯的合成方法，其特征在于，具体步骤为：

（1）制备含拜尔-维立格单氧化酶基因的工程菌和含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌；

（2）分别制备两种工程菌的静息细胞悬浊液；

（3）分别制备含拜尔-维立格单氧化酶的细胞上清液和含葡萄糖脱氢酶基因的细胞上清液

（4）将两种细胞上清液混合，然后与外消旋取代双环[3.2.0]-庚-2-烯-6-酮、溶剂、氢供体和辅因子混合，进行不对称拜尔-维立格氧化反应，制得（1S，5R）-双环内酯；

其中，所述拜尔-维立格单氧化酶基因，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者与SEQID NO.1所示氨基酸序列同源性大于80%的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述的工程菌含有表达载体CHMO-Rhodo1的拜尔-维立格单氧化酶基因，宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

3.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述细胞上清液的制备方法，包括：将所述的工程菌接种到含卡那霉素的培养基上，摇床活化后，扩大至OD₆₀₀值达到0.8-1.2时，加入诱导剂，继续培养，离心收集细胞，用缓冲液重悬，超声破碎，离心，获得所述的细胞上清液。

4.如权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述诱导剂为IPTG，诱导剂的浓度为0.05mM-0.8mM；加入诱导剂后的培养条件为：培养温度为：15 ~ 25℃，培养时间为8 ~ 24h。

5.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于，两种细胞上清液混合液中，含拜尔-维立格单氧化酶的细胞上清液与含葡萄糖脱氢酶基因的细胞上清液的体积比为100:1 ~ 1：2。

6.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述不对称氧化反应的反应式如下：

反应过程中，一方面拜尔-维立格单氧化酶CHMO催化消旋取代双环[3.2.0]-庚-2-烯-6-酮(II)区域选择性的不对称氧化生成立体异构纯的（1S，5R）-双环内酯(I)，同时伴随着还原型辅因子FADH₂转化成为氧化型辅因子FAD的过程；另一方面，葡萄糖脱氢酶将葡萄糖氧化为葡萄糖内酯，同时消耗了氧化型辅酶因子NADP⁺，再生了还原型辅酶因子NADPH，还原型辅酶因子NADPH将氧化型辅酶因子FAD还原为还原型辅酶因子FADH₂，自身又被氧化成氧化型辅酶因子NADP⁺，形成一个辅酶因子消耗与再生的闭合回路，推动主反应的进行。

7.如权利要求6所述的合成方法，其特征在于，所述氢供体为葡萄糖，所述辅因子为NADP⁺/NADPH，FADH₂/FAD。

8.如权利要求6所述的合成方法，其特征在于，不对称氧化反应中，底物浓度为1.0 ~100g/L，制备含拜尔-维立格单氧化酶的细胞上清液的细胞浓度为0.1g_干重/L ~ 25g_干重/L，制备含葡萄糖脱氢酶基因的细胞上清液浓度为0.1g_干重/L ~ 25g_干重/L，氢供体的浓度为5-750g/L，辅因子浓度为0~0.5mM。

9.如权利要求6所述的合成方法，其特征在于，所述不对称氧化反应的温度为20~40℃，反应缓冲液pH为6.0~8.0。

10.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述不对称氧化反应中，所用溶剂为高介电常数的溶剂：二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺；芳香族溶剂：苯、甲苯、乙苯、氯苯、溴苯；非极性溶剂：正己烷、环己烷；极性溶剂：乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、甲醇、乙醇、异丙醇，其中的一种或多种。