[发明专利]大黄酸与姜黄素联用延缓肾纤维化进程差异代谢物代谢通路及研究方法

权利要求书

1.一种大黄酸与姜黄素联用延缓肾纤维化进程差异代谢物代谢通路及研究方法，其特征在于：包括采用超高效液相色谱串联质谱检测NRK-49F细胞纤维化和单侧输尿管结扎诱发的肾纤维化及大黄酸与姜黄素联用干预后的内源性代谢产物，获得指纹图谱；

利用多元统计分析方法，从多个变量中筛选并鉴定出8显著发生变化的代谢物，作为与肾纤维化发生潜在相关差异代谢物；

通过Metaboanalyst富集出与肾纤维化相关的3条代谢通路。

2.根据权利要求1所述的一种大黄酸与姜黄素联用延缓肾纤维化进程差异代谢物代谢通路及研究方法，其特征在于：获得大黄酸与姜黄素联用延缓肾纤维化的差异代谢物代谢通路的具体步骤如下：

(1)大黄酸与姜黄素的制备：将大黄酸25mg/kg和姜黄素25mg/kg溶解在CMC-Na制备；

(2)模型的确定：NRK-49F细胞培养于含10％胎牛血清、1％青链霉素混合液的高糖DMEM培养基中，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中；TGF-β1溶于过滤的蒸馏水中至浓度为50mg/mL，并将其储存在-20℃；在每次实验之前，将TGF-β1的储备溶液用含有2mg/mLBSA的磷酸盐缓冲盐水稀释至10ng/mL；雄性SD大鼠18只，每组6只，共3组，体重220-250g，将SD大鼠随机分别为sham组、UUO模型组、大黄酸与姜黄素联合给药组；

UUO模型的建立：模型组和给药组进行单侧输尿管结扎手术，用10％的水合氯醛0.3mL/100g腹腔注射麻醉后，将大鼠手术处剃毛，竖切口打开腹腔，找到肾脏后小心分离输尿管将两端结扎，中间剪断；假手术组只分离但不结扎；

(3)取对数生长期NRK-49F细胞胰蛋白酶消化后，将约7.5×10⁵个/孔NRK-49F细胞接种到6孔板中；24小时后，用含有1％胎牛血清的高葡萄糖DMEM培养基将细胞饥饿过夜使细胞同步，后随即分为3组(n＝8)对照组、模型组10ng/mL TGF-β1、大黄酸与姜黄素联用组5ng/mL+5μM在37℃和5％CO₂下48小时；快速弃去培养基，加入1mL冷PBS快速洗涤细胞3次，加入1mL-80℃预冷的提取剂淬灭，用细胞刮刀收集细胞后，采用超声波细胞破碎仪进行破碎30min，12000rpm，4℃，离心20min后收集细胞上清液，待测；对于大鼠，术后七天处死，处死前收集大鼠12小时尿液，取样品，25℃解冻后进行甲醇沉淀蛋白前处理，尿液按样品：甲醇＝1：5的比例加入甲醇，涡旋混合30s后，4500rpm离心10min，取上清液待测；

(4)细胞和尿液样本的超高效液相色谱串联质谱检测分析；

(5)将从UPLC-Q-TOF获得的原始数据导入Progenesis QI ver.2.2(NonlinearDynamic)进行峰对齐、解卷积和归一化等处理；

(6)利用多元变量统计分析代谢轮廓差异；采用SIMCA(version 14.0)对细胞和尿液代谢组学不同组别数据进行多元统计分析，包括主成分分析PCA和正交偏最小二乘法判别分析OPLS-DA；通过载荷图代谢物的变量权重重要性排序variable importance in theprojection,VIP，进一步筛选离子；采用IBM SPSS(version 22.0,IBM Corporation,USA)软件进行t检验分析和ROC曲线分析；采用GraphPad Prism软件进行箱式图分析；

(7)筛选潜在生物标志物以空白组和模型组预处理后的超高效液相色谱和质谱检测数据建立正交偏最小二乘法分析模型OPLS-DA，对两组间的差异代谢物进行筛选，采用SPSS22.0软件进行统计学处理；差异代谢物的筛选条件为：选择变量VIP1，且差异在两组间具有统计学意义；

(8)潜在生物标志物的鉴定对筛选出的离子通过QI软件自带的HMDB和LIPD MAPS数据库进行结构鉴定；最终共鉴定8与肾纤维化发生相关的差异代谢产物；

(9)代谢通路富集分析：将细胞和尿液鉴定出的差异代谢产物上传到Metaboanalyst代谢组学分析网站，将代谢产物名字标准化后，选择KEGG数据库，进行相关通路的富集；最后运用Metabo Analyst 4.0平台对差异代谢物进行代谢通路富集；共富集得到3条代谢通路：甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢。