[发明专利]一种检测兰科植物2种软腐病病原物的引物组合与检测方法

权利要求书

1.一种检测兰科植物2种软腐病病原物的引物组合，其特征在于：包括6条引物，真阳性样品会产生两个阳性片段，引物具体序列如下：

达旦提狄克氏菌引物：

Dickeya F85：AAGCTTGCTTCCCCGCCG，

Dickeya R260: CCTACTAGCTAATCCCATCTGGGTT，

Dickeya R418: GAAACCCTGATGCAGCCATG；

胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种引物：

PCC F85：GAAGAGCTTGCTCTTTGGGTGAC，

Pcc R260: CTACTAGCTAATCCCATCTGGGCA，

PCC R418: GCAAGCCTGATGCAGCCAT。

2.根据权利要求1所述的一种检测兰科植物2种软腐病病原物的引物组合，其特征在于，还包括2条内参引物：

ORCH_ACTF850：GTGTGGCTAACACCATCACCAG，

ORCH_ACTR1170：CTGGTTTTGCTGGTGATGATGC。

3.根据权利要求1所述的一种检测兰植物2种软腐病病原物的引物组合，其特征在于，所述病原物为胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种与达旦提狄克氏菌。

4.一种检测兰科植物2种软腐病病原物的方法，其特征在于：

包括如下步骤：

（1）待测样品总DNA提取；

（2）采用权利要求1及2所述引物，以待测样品DNA为模板，以进行PCR反应，获得扩增产物；

（3）1%琼脂糖电泳检测1-6 μL扩增产物，当添加病原物引物PCR产物出现200 bp及335bp大小阳性条带，则表示样品DNA可用且含有胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种与达旦提狄克氏菌病原物，当仅出现兰科内参引物扩增条带，则表示样品DNA可用，但未检测到上述两种病原物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR反应体系为20 μL：DNA模板1 μL，10 μmol/L不同病原或内参上、下游引物各1 μL，2×Taq PCR Mix反应液10 μL，加dd H₂O至总体积20 μL；为避免假阳性，扩增不同病原物引物及内参引物分别在单独PCR管内进行反应。

6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述PCR反应条件为：94℃预变性4 min；94℃变性20 s，52-56 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40 个循环；72 ℃延伸6 min。