[发明专利]一种检测兰科植物2种软腐病病原物的引物组合与检测方法

说明书

本发明提供一种检测兰科植物2种软腐病病原物的引物组合与检测方法。通过两种病原物共有特异性片段设计6条引物，可用于兰科植物检测胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种（Erwinia carotovora subsp.carotovora）与达旦提狄克氏菌(Dickeyadadantii)病原物。本发明通过针对两个病原物三个共有特征位点设计6条引物，真阳性样品可产生两个阳性片段，用于排除假阳性；本发明还增加排除假阴性引物设计，通过针对文心兰、石斛兰、蝴蝶兰两个共有特征位点设计位点，真阴性可产生1个阳性片段。本发明设备要求低，全过程最快仅需要2小时可完成。

技术领域

本发明涉及植物病毒检测领域，具体涉及一种检测兰科植物2种软腐病病原物的引物组合与检测方法。

背景技术

软腐病（soft rot）是多种栽培作物的重要病害，兰科植物极易受软腐病的影响，胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种（Erwinia carotovora subsp.carotovora）与达旦提狄克氏菌(Dickeya dadantii)为导致兰花软腐病的主要病原物，曾在文心兰(Oncidium)、石斛兰(Dendrobium)、蝴蝶兰（Phaleanopsis）等多种软腐病发病植株上被发现。二者具有较近的亲缘关系，并都依赖于分泌的果胶酶、聚半乳糖醛酸酶等胞外酶降解寄主植物细胞壁产生致病性，具传播性强、破坏力大，高温多雨季节可导致兰科植物大面积发病，造成植株大量死亡。由于目前规模化种植的文心兰、石斛兰、蝴蝶兰还未发现对软腐病具有抗性的种质。因此，从种源与环境切断软腐病病原物的传播途径是预防兰科植物软腐病重要手段。

传统清除软腐病病原需通过清除已有症状发病植株来进行。此方法除需要较强的技术经验，还强烈受到环境条件影响，如上述病原物在低温环境不发病，但可在植株内部、土壤与水中潜伏数月且不引起任何症状。因此，利用软腐病病原内在特征物进行检测是发现潜在的软腐病病原的有效技术手段。本发明利用从兰科中分离的不同类型胡萝卜欧文氏菌胡萝卜亚种与狄克氏菌共有序列的特征片段设计引物，可在同时检测胡萝卜欧文氏菌胡萝卜亚种与狄克氏菌，并可利用3个特异位点设计引物，产生两个目的片段以避免假阳性的产生。同时为避免假阴性的产生，本发明还设计1对适用于文心兰、石斛兰、蝴蝶兰的共有基因序列内参引物，可排除由于DNA提取质量及检测程序排除假阴性。

发明内容

针对本领域存在的不足，本发明提供一种检测兰科植物2种软腐病病原物引物组合与检测方法，可同时检测胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种与达旦提狄克氏菌病原物。

本发明采用如下技术方案：

检测兰科植物2种软腐病病原物引物组合，通过针对两个病原物三个共有特征位点设计6条引物，真阳性样品可产生两个阳性片段，具体引物序列如下：

达旦提狄克氏菌:

上游引物：

Dickeya F85：AAGCTTGCTTCCCCGCCG，

下游引物：

Dickeya R260:CCTACTAGCTAATCCCATCTGGGTT，

Dickeya R418:GAAACCCTGATGCAGCCATG，

胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种引物：

上游引物：

PCC F85：GAAGAGCTTGCTCTTTGGGTGAC，

下游引物：