[发明专利]一种抗自切和高比活力胰蛋白酶突变体

说明书

本发明涉及一种抗自切和高比活力胰蛋白酶突变体，具体涉及通过分子改造和筛选获得胰蛋白酶的抗自切和高比活力突变体及其编码基因与应用，属于蛋白质和基因工程技术领域。本发明提供的胰蛋白酶突变体是在SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的基础上发生至少一个以下位点的突变获得的：R107H、R107L、R115S、R115T、K133A、K133A、K147D、K157E、K208P、K210A。比原始酶相比，具有更好的抗自切性能及更高的比活力，相对于野生型胰蛋白酶，抗自切性能提高0.67‑2.88倍，比酶活提高0.07‑2.98倍，改善了胰蛋白酶储存和使用过程中容易自切降低活力的问题。

技术领域：

本发明涉及通过分子改造和筛选获得胰蛋白酶的抗自切和高比活力突变体及其编码基因与应用，属于蛋白质和基因工程技术领域。

背景技术：

胰蛋白酶(EC 3.4.21.4)是一种碱性丝氨酸蛋白水解酶，广泛应用于食品加工、医药及科研等领域。胰蛋白酶作为消化酶，能补充动物内源酶的不足，促进动物吸收营养成分；胰蛋白酶可以在不损伤其他组织的情况下稀释血块、脓液，加快伤口愈合，并能降解细胞间基质及黏附蛋白，具有重要医学价值；胰蛋白酶能使酒类及饮料澄清，可以提高皮革的弹性及柔软度；因其较强的氨基酸位点切割特异性，在科学研究领域被作为重要工具酶使用。

传统上胰蛋白酶主要从动物的胰脏中提取，原料受限且分离纯化困难，混有的糜蛋白酶等杂酶会严重影响酶的特异性水解效果。采用基因工程技术通过微生物重组表达和制备胰蛋白酶，可以提高其产量和纯度，降低分离难度和生产成本。动物来源蛋白可通过原核表达系统或真核表达系统表达。原核表达系统常用的宿主菌是大肠杆菌，其优势在于周期短、成本低以及表达载体选择多样化等，但同时也存在包涵体变性与蛋白复性难度大、纯化困难、目的蛋白难以大量和持续表达等缺点。动物源的胰蛋白酶更适合于采用真核表达系统进行制备和生产，而毕赤酵母是目前真核表达系统最常用的和最完善的宿主。

胰蛋白酶专一水解羧基端为精氨酸和赖氨酸的肽键，具有很强的氨基酸位点特异性。胰蛋白酶不仅能够水解其他蛋白质分子，同时也能攻击自身表面的赖氨酸和精氨酸位点，导致其酶活力在存储或使用过程中快速下降，进而影响其应用效能和水平。通过分子改造提高胰蛋白酶的抗自切能力，有助于提高其稳定性和水解效能。

鉴于天然胰蛋白酶容易自切失活、纯化困难和生产成本高等问题，通过微生物重组表达和分子突变改造研究获得性能更加优异的新型酶分子，对于促进其在科研、医药和食品等领域的应用具有重大意义。

发明内容：

为了解决胰蛋白酶容易自切失活的技术问题，本发明对猪源胰蛋白酶序列中的精氨酸和赖氨酸位点进行定点突变改造(野生猪源胰蛋白酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)，研究证实所获得的胰蛋白酶突变体显著提高了抗自切能力，同时还具有了更高的比活力，这些优异性使之能更好地应用于医药、科研等领域。

本发明的目的是获得抗自切能力和活性皆有提高的胰蛋白酶突变体。本发明在野生胰蛋白酶序列SEQ ID NO.2的基础上，选定其精氨酸或赖氨酸位点作为目标突变位点，通过反向PCR技术进行定点突变。首先，针对目标突变位点进行单点突变，并重组毕赤酵母进行异源表达，通过测定突变酶的抗自切能力和比活力筛选获得10个可以有效提高抗自切能力和比活力的单点突变体，分别命名为P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10，突变位点见表1。然后，采纳这些有效的单点突变进行组合突变，进一步得到10个可以有效提高胰蛋白酶抗自切能力和比活力的多点组合突变体，分别命名为P11、P12、P13、P14、P15、P16、P17、P18、P19及P20，突变组合见表1。

表1突变位点对照表