[发明专利]一种分离、提纯及鉴定坏死杆菌外膜囊泡的方法

权利要求书

1.一种分离、提纯及鉴定坏死杆菌外膜囊泡的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.培养坏死杆菌

将坏死杆菌A25菌株接于苛氧肉汤液体培养基中复苏，在37℃，90％N₂、5％CO₂、5％H₂的厌氧培养箱内静置培养，传2-3代后作为种子液以1:25的比例转接于脑心浸液肉汤液体培养基中，在OD₆₀₀值为0.7-0.9时收获菌液，得到培养后的坏死杆菌；

S2.提取和纯化坏死杆菌外膜囊泡

将步骤一培养的坏死杆菌进行离心、收集上清液、过滤、稀释等步骤提取得到纯化后的坏死杆菌外膜囊泡；

S3.坏死杆菌外膜囊泡组分分析与鉴定

采用Label-free非标记定量蛋白质组学方法分析坏死杆菌外膜囊泡的成分，得到蛋白质鉴定及定量分析结果；

S4.对得到的坏死杆菌外膜囊泡进行特异性免疫实验。

2.根据权利要1所述的一种分离、提纯及鉴定坏死杆菌外膜囊泡的方法，其特征在于，步骤S2所述的提取和纯化OMVs的具体步骤为：

S2.1将坏死杆菌菌液在4℃，8500×g，离心15min，收集离心后的上清液，将收集的上清液用0.22μm的滤膜过滤，收集滤液；

S2.2将滤液移至无菌超速离心管中，在4℃，213000×g，离心2h，弃去上清液，将沉淀用无菌PBS悬浮；

S2.3用pH7.4含有10mM Tricine-NaOH的0.85％NaCl溶液，将60％OptiPrep稀释至35％、30％、25％、20％，用悬浮的坏死杆菌外膜囊泡将60％OptiPrep稀释到浓度为40％，取40％OptiPrep稀释液置于Ultra-Clear离心管底部，依次向上加入浓度为35％、30％、25％、20％的OptiPrep稀释液，并在4℃，135000×g，离心16h；

S2.4离心后，从上至下依次吸取不同浓度的OptiPrep稀释液，然后从中取10μL不同浓度的OptiPrep稀释液进行SDS-PAGE，分析不同浓度的OptiPrep稀释液中坏死杆菌外膜囊泡的含量，不同浓度OptiPrep稀释液的SDS-PAGE结果显示，随着OptiPrep稀释液浓度的增加，条带变浅；

S2.5用无菌PBS将不同浓度的OptiPrep稀释液稀释至少十倍，并在4℃，200500×g，离心2h，去除上清液，将离心后沉淀重悬于无菌PBS中，-80℃保存备用，进行透射电子显微镜观察。

3.根据权利要2所述的一种分离、提纯及鉴定坏死杆菌外膜囊泡的方法，其特征在于，步骤S3所述的坏死杆菌外膜囊泡组分分析与鉴定的包括采用Label-free非标记定量蛋白质组学方法分析坏死杆菌外膜囊泡的成分分析过程S3.1和坏死杆菌外膜囊泡中43K OMP和lktA的Western Blot验证过程S3.2。