[发明专利]一种分离、提纯及鉴定坏死杆菌外膜囊泡的方法

说明书

本发明公开了一种分离、提纯及鉴定坏死杆菌外膜囊泡的方法，通过OptiPrep密度梯度离心法，分离、纯化得到了坏死杆菌外膜囊泡；通过蛋白质组学对纯化的坏死杆菌外膜囊泡成分进行了鉴定与分析，结果显示分离纯化的坏死杆菌OMVs直径为120nm左右，成分以坏死杆菌外膜蛋白43K OMP为主，包含有白细胞毒素等163个蛋白质；通过动物实验证明OMVs能诱导小鼠产生特异性免疫反应，对坏死杆菌A25菌株感染具有100％的免疫保护作用，表明坏死杆菌OMVs具备疫苗候选抗原的潜质，可以用于坏死杆菌高效疫苗的开发。

技术领域

本发明属于坏死杆菌制备疫苗抗原的技术领域，具体涉及一种分离、提纯及鉴定坏死杆菌外膜囊泡的方法。

背景技术

坏死杆菌(Fusobacterium necrophorum)主要是引起牛、羊、猪等多种动物和人坏死性、化脓性疾病的一种人畜共患病病原；在坏死杆菌病中，坏死杆菌病最为严重，主要表现为奶牛腐蹄病和肉牛肝脓肿，引起巨大的经济损失；奶牛腐蹄病平均发病率为10％-20％左右，最高可达到50％，严重影响奶牛的生产性能和产奶质量；牛肝脓肿发病率从1％-95％不等，平均发病率为12％-32％左右，主要危害育成肉牛；近年研究发现，坏死杆菌参与奶牛乳房炎和子宫内膜炎的发生；因此，坏死杆菌在牛临床感染性疾病中扮演着越来越重要的角色，日趋成为热点问题；坏死杆菌属于梭杆菌属、是革兰阴性、杆状、无鞭毛，不形成芽胞和荚膜的一种严格厌氧性细菌；坏死杆菌在自然界的分布极为广泛，是一个以继发感染为主的病原，防控十分困难！随着耐药菌株、抗生素残留和灭活疫苗副作用等问题的出现，新型高效疫苗成为坏死杆菌病有效防治措施的研究热点；

外膜囊泡(Outer membrane vesicles，OMVs)是由革兰氏阴性菌分泌的球形、双层膜状结构，其直径在20-250nm之间，是一种自然不可复制的、高度免疫原性球形纳米颗粒；外膜囊泡的成分以细菌外膜蛋白为主，同时包括周质蛋白、内膜蛋白、细胞壁成分、细胞质成分、毒力因子、DNA、RNA、离子、代谢物和信号分子等成分，具有抗生素抵抗、刺激生物膜形成、传输生物分子、调控应激反应、调节免疫应答、调节微生物稳态、递送致病因子等重要的生物学功能；研究表明，流感嗜血杆菌OMVs能诱导小鼠产生黏膜免疫和体液免疫反应，对异源的流感嗜血杆菌感染具有保护作用；脆弱类杆菌OMVs释放的荚膜多糖，具有免疫调节作用，能预防结肠炎；布鲁氏菌OMVS能诱导小鼠的体液免疫和细胞免疫应答，显著增强Th1型细胞免疫反应；B型脑膜炎奈瑟球菌OMVs疫苗已经在多个国家和地区被广泛应用；OMVS作为疫苗抗原对土拉菌亚种、假性伯克霍尔德菌和溶血性曼氏菌等人类病原菌具有免疫保护作用；由此可见，OMVs以其稳定的纳米颗粒结构，同时包含细菌多种抗原蛋白，使其成为疫苗抗原候选靶标，是目前细菌新型高效疫苗研究的热点；

目前，关于坏死杆菌OMVs作为疫苗抗原等相关研究未见报道，而如果能将坏死杆菌OMVs作为疫苗抗原应用于疾病防治中，可以极大程度的对坏死杆菌OMVs进行利用，将是细菌新型高效疫苗研究的一个福音。

发明内容

针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种分离、提纯及鉴定坏死杆菌外膜囊泡的方法，包括坏死杆菌A25菌株的培养、坏死杆菌OMVs的离心、分离、纯化等步骤，通过动物的特异性免疫实验证明了坏死杆菌OMVs能诱导小鼠产生特异性免疫反应，对坏死杆菌A25菌株感染具有100％的免疫保护作用，证明坏死杆菌OMVs具备疫苗候选抗原的潜质。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种分离、提纯及鉴定坏死杆菌外膜囊泡的方法，包括以下步骤：

S1.培养坏死杆菌