[发明专利]一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针的构建方法及其产品和应用

权利要求书

1.一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

(1)制备DNA探针：根据待测的miRNA分子序列合成与所述miRNA分子配对的DNA探针，所述DNA探针的一端修饰荧光基团，另一端修饰生物素；

(2)偶联培育：将所述DNA探针预热后与链霉亲和素磁珠悬浊液混合，在30-40℃条件下培育；

(3)清洗：首先将培育后的混合物用NaOH溶液清洗除去非特异性结合或游离的DNA探针，然后用TT缓冲液重复清洗，再次将DNA探针加入到TT缓冲液中进行重悬后在80℃下培育，除去液体以去除结合不稳定的偶联分子，最后用DEPC水清洗即可得到一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述miRNA分子包括肿瘤疾病或病毒传染性疾病的疾病标志物miRNA。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述链霉亲和素磁珠悬浊液按照如下方法制备：

将超顺磁性微球与链霉亲和素通过共价结合形成链霉亲和素磁珠，在室温条件下，用IBM缓冲液清洗并用永久磁铁固定链霉亲和素磁珠后滤掉上层清液，再分散到固定清洗缓冲液中即可。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述DNA探针与链霉亲和素磁珠在混合过程中按照每20pmol DNA与40μg MBs链霉亲和素磁珠混合的比例进行。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述预热为在70～85℃下预热5～30min；所述培育时间为10min以上。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，所述NaOH溶液的浓度为0.15M；所述TT缓冲液按照如下方法配制：向pH＝8.0的250mM的Tris-HCl缓冲液中加入0.1％的20混合而成。

7.由权利要求1～6任一项所述构建方法构建得到的磁性微球DNA探针。

8.权利要求7所述的磁性微球DNA探针在检测miRNA分子方面的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述miRNA分子为肺癌标志物miRNA时，按照如下方法进行检测：首先向所述磁性微球DNA探针中加入所述miRNA、DSN和RNase抑制剂，在热循环仪中反应；然后用磁铁固定磁珠后提取上层清液，测试上清液的荧光强度，从荧光强度得到所述miRNA的浓度。