[发明专利]一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针的构建方法及其产品和应用

说明书

本发明涉及一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针的构建方法及其产品和应用，属于分子探针技术领域。本发明提供了一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针，能在保持样本中初始miRNA数量不变的前提下实现检测信号的线性放大。由于该探针在检测过程中无需进行PCR，避免了非特异性扩增，从而提高了检测的特异性。与传统的分离方法相比，把磁珠用于生化样品复杂组分的分离，能够实现分离和富集的同时进行，有效地提高了分离速度和富集效率，同时也使分析检测的灵敏度大大提升。

技术领域

本发明属于分子探针技术领域，具体涉及一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针的构建方法及其产品和应用。

背景技术

癌症也叫恶性肿瘤，具有增殖异常、生长失去控制、浸润性和转移性等生物学特征。它可以破坏组织、器官的结构和功能，引起坏死出血合并感染，患者最终可能由于器官功能衰竭而死亡。目前，肺癌仍然是最具威胁生命的疾病，由于其发病率和死亡率的居高不下，在世界范围内越来越普遍。根据国家癌症中心发布的统计数据，2015年我国新发肺癌患者例数为78.7万，约占癌症新患病例的20％。更糟糕的是，未来几十年，肺癌新增病例数量预计将翻一番，这会给国家社保系统、医疗系统和家庭生活带来重大负担。

虽然近几十年来在诊治方面做了很多努力，但肺癌的预后仍然很差，肺癌在5年内生存率低于15％。这主要是由于肺癌诊断时间常在晚期，治疗性手术不再作为选择。因为肺癌在初期的发展非常隐蔽，主要表现为：呼吸短促、咳嗽和体重下降等症状，常常也属于着肺炎症状，故肺癌确诊是一个难点。传统的肺癌的早期检测技术包括胸部X线摄影、低剂量计算机断层扫描(LDCT)和肺活检。然而，这些技术在肺癌的早期检测中存在一些局限性，包括高假阳性率、侵袭性、潜在的过度诊断、过高的成本或辐射诱发的癌症。另一方面，标准免疫测定法(如ELISA、RIA、IF等)已成为检测LC生物标志物的成熟技术，但耗时、成本高，只能在集中的实验室中进行。此外，这些免疫测定法大多为单重测定法，对检测疾病早期低浓度的生物标志物不够敏感。所以需要开发一种灵敏度高的早期肺癌检测技术。

近年来，许多科学家提出了通过标志物来诊断肺癌，其中对miRNA的研究较多。miRNA是一种非编码RNA，一般是18-25个碱基长度。研究表明，人类约30％的基因受到miRNA的调控，miRNA的表达水平与人类多种疾病的发生密切相关。传统定量检测miRNA的方法主要包括Northern blotting、原位杂交、微阵列法、滚环扩增和反转录聚合酶链反应等。这些方法大体可以归为无需样本扩增的探针直接杂交法和基于样本miRNAs扩增的检测方法。它们各有优缺点：不经过扩增的方法操作简便，但对样本量需求较大，且灵敏度较低；而基于扩增的方法灵敏度较高，但其受限于无法直接检测miRNAs水平和非特异性扩增。其原因在于miRNAs的序列很短，这些扩增手段及相应的探针设计都需要非常精细和复杂的设计。传统PCR技术大都通过检查其前体而进行间接判断，

因此，现有的诊断方法并不能反映真实的miRNAs水平，并且，miRNAs在体液中的表达量远低于其在组织中的表达，因此常规检测组织中miRNAs的技术并不一定适用于体液miRNAs的检测，需要讲究新的能够增强检测信号的探针以及方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针的构建方法；本发明的目的之二在于提供一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针；本发明的目的之三在于提供一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针在检测miRNA方面的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：

(1)制备DNA探针：根据待测的miRNA分子序列合成与所述miRNA分子配对的DNA探针，所述DNA探针的一端修饰荧光基团，另一端修饰生物素；