[发明专利]一种调控生长速度筛选1,3-丙二醇生产菌株的方法

说明书

本发明公开了一种调控生长速度筛选1，3－丙二醇生产菌株的方法，该方法包括紫外诱变连续传代富集以及后续的复筛和发酵转化甘油形成1，3－丙二醇，该方法通过调控菌体的生长速度、采用特定的连续传代富集步骤，高效地富集出了生长优势的突变株。与现有技术相比，采用本发明的方法显著地提高了紫外诱变后的筛选效率，实现了高生长速度1，3－丙二醇生产菌株的高通量筛选。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说，即：通过菌体生长速度的调控和特定的连续传代富集步骤，高效地富集出具有生长优势的突变株，从而实现了高生长速度1，3-丙二醇生产菌株的高通量筛选。

背景技术

1，3-丙二醇(1，3-porpanediol，简称1，3-PD)是一种重要的化工原料，可用作溶剂、抗冻剂或保护剂、精细化工原料以及新型聚酯——聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)和聚氨酯的单体。目前，自然界中能将甘油转化为1，3-PD的微生物大致包括：克雷伯氏杆菌(Klebsiela)、弗氏柠檬菌(Citrobacter)、丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridium)等等。其中克雷伯氏杆菌因生物转化效率高、生物转化过程操作方便，研究应用最多。

但是自然界中筛选的克雷伯氏杆菌，一般副产物都比较多。目前解除这些副产物常常采用代谢工程的手段敲除特定副产物的代谢途径。研究发现这些代谢途径敲除后副产物减少的同时，有时会对菌体的生长产生负面的影响。此外，对菌株的其他分子改造，也常常伴随着被改造菌株生长性能的下降。

因而，恢复、提高这些基因工程菌株的生长性能是提高其1，3-丙二醇发酵水平的有效方法。

目前，紫外诱变是一种使用时间最长、范围广泛、效果显著的诱变方法。波长260nm的紫外线照射能够引起碱基的移码突变、缺失、转换等。该方法操作简单、安全且诱变率高。通过紫外诱变能够随机产生不同的突变性状。可是，筛选需要的正向突变株是一个复杂而困难的过程。

理论上，紫外诱变后，可以通过连续培养的方法富集生长速度快的突变株，但是实际操作过程中由于突变菌株生长速度优势不明显，连续传代次数过多易染菌和回复突变等，通常的连续传代很难实现目标菌株的富集，高通量地筛选出目标菌株。

本发明公开了一种高效的连续传代富集方法，即：通过调控菌体的生长速度采用特定的连续传代步骤，高通量地筛选出具有生长优势的1，3-丙二醇生产菌株。经过检索国家知识产权局(www.sipo.gov.cn)、世界产权组织(www.wipo.int)、欧洲专利局(www.espacenet.com)和美国专利商标局(www.uspto.gov)也没有发现与本专利保护请求相同的公开专利或授权专利。

发明内容

本申请的发明人在研究中发现，通过改良的M9培养基调控菌株的生长速度后，经过特定的连续传代培养，可以高效地筛选出生长优势的1，3-丙二醇生产菌株。与现有技术相比，采用本发明的方法显著地提高了紫外诱变后的筛选效率，实现了高生长速度1，3-丙二醇生产菌株的高通量筛选。

本发明“高通量筛选1，3-丙二醇生产菌株的方法”是通过以下的技术方法实现的：采用改良的M9培养基，经过特定的连续传代培养，高效地富集出有生长优势的突变株。本发明包括富集前对出发菌株进行紫外诱变，以及富集后的复筛和发酵转化甘油生成1，3-丙二醇。

根据本发明所述的改良M9培养基为：

Na₂HPO₄ 3.39g/L，KH₂PO₄ 1.5g/L，NaCl 0.25g/L，NH₄Cl0.5g/L，MgSO₄ 0.12g/L，CaCl₂ 0.005g/L，甘油15g/L，调整pH7.0。

根据本发明所述的连续传代培养具体为：