[发明专利]一种利用发根农杆菌诱导产生玫瑰毛状根的方法

说明书

一种利用发根农杆菌诱导产生玫瑰毛状根的方法，属于植物生物技术工程领域。包括发根农杆菌保存、活化与侵染液的制备；外植体的预培养和共培养；农杆菌侵染诱导毛状根；毛状根液体增值培养。本发明利用毛状根生长速度快的特点，解决野生玫瑰植株稀缺无法大规模用于药用成分提取的技术问题。

技术领域

本发明属于植物生物技术工程领域，涉及一种玫瑰（Rosa rugosa Thunb.）毛状根的培养方法，具体是一种利用发根农杆菌诱导产生玫瑰毛状根的方法。

背景技术

玫瑰（Rosa rugosa Thunb.）是蔷薇科蔷薇属植物，直立灌木，因其精油含量高、品质好且为国际香型，栽培面积不断扩大，近年来，玫瑰药用价值日益受到重视。一方面，药典记载，玫瑰花能止痛消肿，活血化瘀，另一方面，玫瑰花提取物活性研究证实，其中有很大一部次生代谢物具有潜在的抗自由基、抗肿瘤和抗氧化作用。植物化学的最新研究发现，玫瑰根系中高含量的野蔷薇苷有重要药用价值：可以促进心肌细胞在低压缺氧环境下对氧自由基清除，有望应用于急性低压缺氧诱导的心肌损伤保护；对HIV-1蛋白酶活性的抑制作用较强（达50.3%），有望作为重要的艾滋病抗病毒治疗的HIV-1蛋白酶抑制剂。目前的代谢物生物反应器中，利用植物组织培养技术生（如愈伤组织）获取代谢产物相关技术获得了迅速发展，但是由于细胞培养为脱分化状态的细胞团，激活的生物学通路和次生代谢通路并不一致，因而次生代谢产物的生产能力低且不稳定，且其产生代谢物效率不如已经高度分化的天然植物组织，加上无菌环境成本过高，从而限制了其产业化的发展。

玫瑰中化合物成分复杂、含量低，性质不稳定易分解等使得精油、野蔷薇苷等重要代谢物获取难度较大，且野生玫瑰是国家二级保护植物，难以大规模用于野蔷薇苷等药用成分的提取，组织培养技术无法建立满足生产需求的高效玫瑰生物反应器。而经过发根农杆菌侵染植物所形成的毛状根（hair root)，是一种恶性增殖的器官，相对于常规细胞培养，其具有激素自养、生长迅速、周期短等特点，因而可进行大量培养，同时它起源于单细胞，遗传性状稳定，拥有亲本植株的特征次生代谢途径。由于其生长迅速且遗传性状稳定十分有利于天然药物的开发与利用，成为药用植物次生代谢产物生产的重要原料，目前，人参、黄芪等多种药用植物建立了毛状根诱导和培养体系，大约有百种药用植物的毛状根被成功诱导，76%为草本植物，藤本和木本植物数量较少，大约为7%和17%。结合遗传转化，以毛状根为载体，通过筛选获得优化条件后，可获得更高产量的有效药用成分。对于某些提取受限的野生药用植物资源来说，毛状根培养发展是因势利导，成为一项由基因工程和细胞工程相结合的新技术。

建立玫瑰毛状根诱导技术体系，利用玫瑰根系拥有亲本特征次生代谢途径，可以作为玫瑰重要次生代谢物的扩大生产的生物反应器，也为进一步挖掘野生玫瑰（二级濒危）中高价值代谢物打破了植物原材料限制。

发明内容

本发明的目的是提出一种玫瑰毛状根诱导方法，即一种利用发根农杆菌诱导产生玫瑰毛状根的方法，利用毛状根生长速度快的特点，解决野生玫瑰植株稀缺无法大规模用于药用成分提取的技术问题。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

1.侵染液的制备：

在无菌条件下，接种根癌农杆菌ATCC15834活化菌液50μL于50mL YEB液体培养基中，28°C 、200 rpm震荡培养至OD600=0.5左右。取菌液5000 rpm离心5~10 min后去上清，加入等体积的1/2MS液体培养基，重悬混匀，置于28°C、 100~110 rpm摇床震荡培养20~30 min后得到侵染液。

2.外植体的预培养和共培养：

在无菌条件下，选取继代20天左右，长势良好的玫瑰组培苗，将其幼嫩叶片切成0.6cm²的小块，背面向上置于固体培养基上培养2d后，将叶片小块浸入准备好的菌液中，轻摇5~20min，使外植体和菌液充分接触取后出叶片小块，用无菌滤纸吸干表面菌液，置于固体培养基上暗培养2~3 d。