[发明专利]一种有效获取大花序桉无菌幼化芽的方法

权利要求书

1.一种有效获取大花序桉无菌幼化芽的方法，其特征在于：包括优树选择、水培促萌、外植体采集及处理、诱导培养和幼化培养工序，选择大花序桉优树，在优树中上部选取直径3-4cm，完全木质化且带潜伏芽的枝条，带回培养室进行水培，待潜伏芽萌发并生长至3-4cm时，剪取茎段作为外植体并进行消毒后，接种于诱导培养基中进行诱导培养，将获得的大花序桉初始芽接种到幼化培养基上进行幼化培养，最后获得生长健壮、活力旺盛的大花序桉无菌幼化芽；

主要操作步骤如下：

（1）优树选择

选择样地内树高、胸径、单株材积等生长指标前5%，且无病虫害、干形通直、分枝小的大花序桉个体为优树；

（2）水培促萌

选择优树中上部直径3-4cm，完全木质化且带潜伏芽的枝条，剪取60cm长去除叶片，带回培养室进行水培，每隔4天用体积浓度为2%的绿茶提取物对枝条进行一次喷洒杀菌；

（3）外植体采集及处理

待潜伏芽萌发并生长至3-4cm时，剪取2-3cm茎段作为外植体，将外植体用75%酒精浸泡30s，无菌水清洗2-3次，然后用体积浓度2%次氯酸钠浸泡2min，最后用无菌水清洗2-3次，用滤纸吸干，备用；

（4）诱导培养

将步骤（3）处理好的外植体接种到诱导培养基上进行诱导培养，暗培养10d后，在温度25±2℃，光照12h/d，光照强度1500-2000lux条件下培养20-25d，获得大花序桉初始芽；

（5）幼化培养

将获得的大花序桉初始芽接种到幼化培养基上进行幼化培养，在温度25±2℃，光照12h/d，光照强度1500-2000lux条件下，20-25d转接一次，获得丛芽后每次切取丛芽顶端1-2cm在幼化培养基上进行3-6个周期的反复培养，获得生长健壮、活力旺盛的大花序桉无菌幼化芽；

步骤（2）所述的水培的培养基包括以下组分：每1L培养基中含50mg绿茶提取物，2.5mg核黄素（VB₂），0.2mg萘乙酸（NAA），其余为纯水；

步骤（4）所述的诱导培养基为：改良MS培养基+5mg/L聚乙烯吡咯烷酮（PVP）+5mg/L柠檬桉提取物+0.5mg/L叶酸（VB₉）+0.24mg/L生物素（VH）+2.5mg/L L-半胱氨酸+0.2mg/L激动素(KT)+0.6mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+30g/蔗糖+5g/L琼脂粉；

其中改良MS培养基的配方为：1L培养基含1800mgKNO₃、1600mgNH₄NO₃、170mgKH₂PO₄、400mgCaCl₂、360mgMgSO₄、6.2mgH₃BO₃、25 mgMnSO₄、10 mgZnSO₄、0.25 mgNa₂MoO₄、0.025mgCuSO₄、0.025 mgCoCl₂、0.83 mgKI、5mgPVP、5mg柠檬桉提取物、0.5mg叶酸（VB₉）、0.24mg生物素(VH)、2.5mgL-半胱氨酸、2mg甘氨酸、5mg烟酸(VB₃)、2mg硫胺素(VB₁)、0.5mg吡哆素(VB₆)、37.3mg Na₂-EDTA、27.8mg FeSO₄、100mg肌醇、0.2mg激动素（KT）、0.6mg6-BA、0.3mgNAA、30g蔗糖、5g琼脂粉、pH 值5.8~6；

步骤（5）所述的幼化培养基为：改良MS培养基+5mg/L聚乙烯吡咯烷酮（PVP）+5mg/L柠檬桉提取物+0.025mg/L氯化铝（AlCl₃）+0.5mg/L叶酸（VB₉）+0.24mg/L生物素（VH）+2.5mg/L L-半胱氨酸+0.4mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.1mg/LGA₃+30g/L蔗糖+5g/L琼脂粉；

其中改良MS培养基的配方为：1L培养基含1800mgKNO₃、1600mgNH₄NO₃、170mgKH₂PO₄、400mgCaCl₂、360mgMgSO₄、6.2mgH₃BO₃、25 mgMnSO₄、10 mgZnSO₄、0.25 mgNa₂MoO₄、0.025mgCuSO₄、0.025 mgCoCl₂、0.83 mgKI、0.025mgAlCl₃、5mgPVP、5mg柠檬桉提取物、0.5mg叶酸（VB₉）、0.24mg生物素(VH)、2.5mgL-半胱氨酸、2mg甘氨酸、5mg烟酸(VB₃)、2mg硫胺素(VB₁)、0.5mg吡哆素(VB₆)、37.3mg Na₂-EDTA、27.8mg FeSO₄、100mg肌醇、0.4mg6-BA、0.2mg NAA、30g蔗糖、5g琼脂粉、pH 值5.8~6；

所述的柠檬桉提取物是柠檬桉叶用水蒸气蒸馏获取油样母液，稀释10倍后获得的；

所述的绿茶提取物的制备方法是：将绿茶粉末加入乙醇—水溶液，于50-55℃恒温水浴条件下进行2-3次超声波提取，得到混合液，再将混合液进行微波提取，过滤，得到绿茶提取液；

其中，所述的绿茶粉末与乙醇—水溶液的料液比为：1： 20-40g/mL

所述乙醇-水溶液中乙醇的体积分数为70％-90％；

所述的超声时间为10-60min；超声功率为200-500w；

所述的微波功率为160-480w；微波时间为30-60s。