[发明专利]一种桉树组培外植体制备及无菌芽诱导方法

权利要求书

1.一种桉树组培外植体制备及无菌芽诱导的方法，其特征在于：包括优树选择，环割促萌，水培促萌，外植体处理和诱导培养工序，选择桉树优树，在离地面20-25cm处进行环割促萌，待萌芽条生长至直径2-3cm时，剪取60cm长、完全木质化且带潜伏芽的枝条在培养室中进行水培，待潜伏芽萌发并生长至3-4cm时，剪取茎段作为外植体并进行消毒后，接种于诱导培养基中，置于适宜的环境中进行诱导培养，最后获得生长健壮、活力旺盛的桉树无菌芽；主要的操作步骤如下：

（1）优树选择

选择样地内树高、胸径、单株材积等生长指标前5%，且无病虫害、干形通直、分枝小的桉树个体为优树；

（2）环割促萌

铲除优树周围杂灌，环割前一天于优树周围喷晒75%酒精进行消毒，在优树离地面20-25cm处进行环割树周长的3/4，环割宽度2 cm，剥皮并刮尽形成层至韧皮部；

（3）水培促萌

待萌芽条生长至直径2-3cm时，剪取60cm长、完全木质化且带潜伏芽的枝条，去除叶片，带回培养室进行水培，每4天喷洒一次体积浓度2%的绿茶提取物抑菌；

（4）外植体处理

待潜伏芽萌发并生长至3-4cm时，剪取2-3cm茎段作为外植体，将外植体用75%酒精浸泡15s，无菌水清洗2-3次，然后用2%次氯酸钠浸泡1min，最后用无菌水清洗2-3次，用滤纸吸干，备用；

（5）诱导培养

将步骤（4）处理好的外植体接种到诱导培养基上进行诱导培养，暗培养7d后，在温度25±2℃，光照12h/d，光照强度1500-2000lux条件下培养20-25d，获得生长健壮、活力旺盛的桉树无菌芽；

步骤（3）所述的水培的培养基包括以下组分：每1L培养基中含50mg绿茶提取物，2.5mg核黄素（VB₂），其余为纯水；

步骤（5）所述的诱导培养基为：改良MS培养基+5-10mg/L 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）+2.4mg/L D-泛酸钙（VB₅）+0.24mg/L生物素（VH）+2.5mg/L L-半胱氨酸；

所述的改良MS培养基的组成为：1800mg/L KNO₃、360mg/L NH₄NO₃、270mg/L KH₂PO₄、200mg/L CaCl₂、360mg/L MgSO₄、10mg/L H₃BO₃、25 mg/L MnSO₄、10 mg/L ZnSO₄、0.25 mg/LNa₂MoO₄、0.025 mg/L CuSO₄、0.025 mg/L CoCl₂、0.83 mg/L KI、1000mg/L PVP、2.4mg/L D-泛酸钙（VB₅）、0.24mg/L生物素（VH）、100mg/L L-半胱氨酸、2mg/L甘氨酸、5mg/L烟酸（VB₃）、2mg/L硫胺素（VB1）、0.5mg/L吡哆素（VB₆）、37.3mg/L Na₂-EDTA、27.8mg/L FeSO₄、100mg/L肌醇、0.4mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、30g/L蔗糖、6g/L琼脂粉，pH 值5.8~6.2；

所述的绿茶提取物的制备方法是：将绿茶粉末加入乙醇—水溶液，于50-55℃恒温水浴条件下进行2-3次超声波提取，得到混合液，再将混合液进行微波提取，过滤，得到绿茶提取液；

其中，所述的绿茶粉末与乙醇—水溶液的料液比为：1： 20-40g/mL；

所述乙醇-水溶液中乙醇的体积分数为70％-90％；

所述的超声时间为10-60min；超声功率为200-500w；

所述的微波功率为160-480w；微波时间为30-60s。