[发明专利]基于LC-MS/MS对生物样本中胆红素的降解产物的检测分析方法

权利要求书

1.一种基于LC-MS/MS对生物样本中胆红素的降解产物的检测分析方法，其特征在于，检测分析步骤包括选取液相条件、设定质谱条件、制备标准溶液、优化分析方法、绘制标准曲线、样品前处理和脑脊液中产物的定性定量检测；通过所述检测分析方法，对脑脊液中BOX A、BOX B和hematinic acid三个化合物进行快速准确测定，同时，所述检测分析方法还用于测量细胞裂解液和血液样本信息。

2.根据权利要求1所述基于LC-MS/MS对生物样本中胆红素的降解产物的检测分析方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1：选取液相色谱柱并设定质谱条件和参数：

a.设置高效液相色谱条件：

色谱柱：Agilent Poroshell EC-C18色谱柱，2.1×100mm,2.7μm；柱温：30℃；设定流动相及流动相梯度，其中，水相A：水和0.1％(v/v)甲酸，有机相B：甲醇和0.1％(v/v)甲酸、甲醇、乙腈或乙腈和0.1％(v/v)甲酸，流速为0.3mL/min，设置LC-MS/MS进样体积1-20μL；

b.设置质谱条件：

选择电喷雾离子源(ESI)，根据化合物的响应，选择合适的离子扫描模式；

c.设定质谱定性定量检测模式：

多反应监测方法(MRM)，设定多反应监测模式参数；

S2：制备标准溶液：

a.分别称取2mg的BOX A、BOX B和hematinic acid溶于1.1mL水中，制得10mM母液；

b.用水稀释，配制成摩尔浓度为500μM的hematinic acid溶液、分别为10μM的BOX A和BOX B，避光储存于4℃冰箱中，备用；

S3：使用标准溶液进行仪器分析方法优化，获得优化后的LC-MS/MS定量分析方法，其中，所述仪器为液相色谱-串联三重四极杆质谱联用仪；

S4：绘制标准曲线：

将在所述S2步骤中配制好的hematinic acid标准母液按比例稀释后配成摩尔浓度分别为1、5、10、50、100、150、200μM的hematinic acid标准溶液，分别将BOX A和BOX B标准母液按比例稀释成摩尔浓度为5、10、50、100、200、400、600、800、1000nM的BOX A和BOX B标准溶液，进样体积1μL；以峰面积对目标物的摩尔量绘制标准曲线，其中峰面积对应纵坐标y参数，目标物的摩尔量对应横坐标x参数；

S5：样品前处理：

将脑脊液样品加入9倍体积的冰乙醇，于冰上放置30-60min，在15000rpm下离心处理15-45min，取上清液；将上清液用离心浓缩仪浓缩干，重溶；过0.22μm滤膜，对滤液进行上机测试；

S6：外标法定量：

通过在所述步骤S5对样品进行前处理后，根据绘制的色谱图，计算出脑脊液中各化合物的峰面积，并通过在步骤S4中得到所述标准曲线计算出样品溶液中BOX A、BOX B和hematinic acid的浓度，BOX A和BOX B在5-1000fmol范围内，hematinic acid在1-200pmol范围内的线性关系，并计算仪器的计算仪器的方法检出限(LOD)、定量检测限(LOQ)和检测重复性信息，同时计算日内和日间精密度。

3.根据权利要求2所述基于LC-MS/MS对生物样本中胆红素的降解产物的检测分析方法，其特征在于：在所述步骤S1的步骤a中，选用的LC-MS/MS仪器为Agilent 1290高效液相色谱系统和AB SCIEX 4500三重四级杆质谱系统。

4.根据权利要求2所述基于LC-MS/MS对生物样本中胆红素的降解产物的检测分析方法，其特征在于：在所述步骤S1的步骤b中，设置质谱条件如下：

选择电喷雾离子源(ESI)，并根据离子响应，BOX A和BOX B为正离子模式扫描，hematinic acid为负离子模式扫描，采用半自动进样方式，以7-20μL/min的流速将300μg/L的标准储备液分别注入离子源，选取对应的母离子峰，对其子离子进行二级质谱分析，得到碎片离子信息，建立MRM扫描方法及参数。