[发明专利]基于LC-MS/MS对生物样本中胆红素的降解产物的检测分析方法

说明书

本发明公开了一种基于高效液相色谱‑串联质谱(LC‑MS/MS)测定生物样本中三种胆红素氧化产物BOX A、BOX B和hematinic acid含量的方法。本发明利用高效液相色谱‑三重四级杆质谱联用技术检测样品中胆红素氧化产物BOX A、BOX B和hematinic acid含量。样品经去蛋白处理，用LC‑MS/MS仪器MRM模式分析，外标法定量。本发明的方法具有简单快速、检测限低、稳定性好、检测灵敏度高和重复性好的优势，用于生物样本中胆红素的氧化产物的测定，能够满足生物样本中目标物的检测要求，具有高灵敏度和高选择性，抗干扰能力强，可以成为胆红素氧化产物定性定量分析的有效工具。

技术领域

本发明涉及一种生物样本的检测分析方法，特别是涉及一种脑脊液中胆红素的降解产物的检测分析方法，应用于生物样品目标化合物检测技术领域。

背景技术

脑卒中也称中风，是一种急性脑血管疾病，具有高发病率、高致残率、高死亡率、高复发率的特点。脑卒中包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中出血性脑卒中是大脑动脉血管破裂出血造成的，血液溢入脑组织，导致脑组织受损，从而产生大脑局部功能障碍。蛛网膜下腔出血是出血性脑卒中的一种，其病死率高于脑卒中的平均死亡率。

研究表明，蛛网膜下腔出血后的红细胞裂解是影响患者康复的主要原因。血液中的红细胞裂解释放血红蛋白，血红蛋白中的血红素进一步降解为胆绿素，胆绿素在胆绿素还原酶的作用下还原为胆红素。胆红素作为一种还原剂，可清除活性氧，由于其具有抗氧化性，可作为细胞发生氧化应激时的保护剂。研究表明，大脑出血会引起强烈的氧化应激，释放活性氧，胆红素作为还原剂，在遇到H₂O₂后氧化为小分子化合物，其中BOX A

(2-(3-ethenyl-1,5-dihydro-4-methyl-5-oxo-2H-pyrrol-2-ylidene)acetamide，bilirubin oxidizedA，CAS#329314-76-3)、BOX B

(2-(4-ethenyl-1,5-dihydro-3-methyl-5-oxo-2H-pyrrol-2-ylidene)acetamide，bilirubin oxidizedB，CAS#329314-75-2)和hematinic acid(2,5-dihydro-4-methyl-2,5-dioxo-1H-pyrrole-3-propanoic acid，CAS#487-65-0)是已报道的H₂O₂氧化下胆红素的降解产物。经实验验证，BOXA和BOX B可引起大鼠脑血管严重且持久的血管痉挛，具有重要的生理意义；hematinic acid是最早报道的胆红素氧化产物，至今还没有关于该化合物的生物学研究。而要研究胆红素氧化产物对脑出血并发症的贡献，最直接有效的方法是检测临床样本中各化合物的浓度，并评估各化合物浓度与疾病的关系。但到目前为止，依然缺少高灵敏度和高选择性的检测方法。

发明内容

为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种基于LC-MS/MS对生物样本中胆红素的降解产物的检测分析方法，通过使用液相色谱-串联三重四极杆质谱联用仪，建立胆红素氧化产物BOX A、BOX B和hematinic acid三个化合物的定性与定量方法，利用三种化合物的标准品进行仪器分析方法优化，包括液相色谱条件、质谱检测条件及质谱参数优化，达到测定三种化合物准确、快速、灵敏度高的检测要求。

为达到上述发明创造目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于LC-MS/MS对生物样本中胆红素的降解产物的检测分析方法，检测分析步骤包括选取液相条件、设定质谱条件、制备标准溶液、优化分析方法、绘制标准曲线、样品前处理和脑脊液中产物的定性定量检测；通过所述检测分析方法，对脑脊液中BOX A、BOX B和hematinic acid三个化合物进行快速准确测定，同时，所述检测分析方法还用于测量细胞裂解液和血液样本信息。