[发明专利]一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以黄曲霉毒素B1单克隆抗体为免疫原对无病原体免疫动物进行免疫，得到黄曲霉毒素B1抗抗体；

(2)将步骤(1)得到的黄曲霉毒素B1抗抗体与辣根过氧化物酶进行偶联得到酶标记的黄曲霉毒素B1抗抗体；

(3)用包被缓冲液将包被黄曲霉毒素B1抗原稀释，注孔，避光孵育，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤，静置，拍干，然后在孔中加入封闭液，再避光孵育，倾去孔内液体拍干，干燥后得到酶标板，用铝膜真空密封保存；

(4)建立黄曲霉毒素B1标准品浓度相对吸光度的标准曲线，并根据该标准曲线由待测样品的吸光度推算出待测样品中的黄曲霉毒素B1含量。

2.根据权利要求1所述的一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法，其特征在于，所述免疫动物为山羊。

3.根据权利要求1所述的一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法，其特征在于，所述黄曲霉毒素B1单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：将包被黄曲霉毒素B1抗原注入到Balb/c小鼠体内，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔；利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌黄曲霉毒素B1单克隆抗体的杂交瘤细胞株；注射细胞进小鼠体内诱生腹水；将采集的腹水用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。

4.根据权利要求2所述的一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法，其特征在于，所述包被黄曲霉毒素B1抗原的制备方法，包括以下步骤：

1)将黄曲霉素B1和羧甲基羟半盐酸盐溶于吡啶甲醇混合溶液中，搅拌，旋干，加入双蒸水溶解，随即用碳酸氢钠调节pH至8.0，苯酚萃取，再用硫酸调节液相pH至4.0，在氮气保护下浓缩，得到黄色油状液体即为AFB1肟化物黄曲霉毒素B1抗原；

2)将得到的AFB1肟化物黄曲霉毒素B1抗原溶于DMF中，加入碳二亚胺盐酸盐，搅拌，取BSA溶解于LPBS缓冲液中，将此溶液加入反应液中，相同条件继续反应，离心后用PBS透析，得到免疫黄曲霉毒素B1抗原；

3)将免疫黄曲霉毒素B1抗原、N羟基琥珀亚胺和二环己基碳二亚胺溶解于无水四氢呋喃中震荡反应，离心，取上清吹干，加入DMF；取OVA溶解于PBS缓冲液中，加入到反应物中反应，离心后用PBS透析，得到包被黄曲霉毒素B1抗原。

5.根据权利要求1所述的一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法，其特征在于，所述包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐溶液。

6.根据权利要求5所述的一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法，其特征在于，在步骤(3)中，用pH9.6碳酸盐将包被黄曲霉毒素B1抗原稀释成5μg/mL。

7.根据权利要求6所述的一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法，其特征在于，在步骤(3)中，每孔加入150μl稀释后的包被黄曲霉毒素B1抗原稀释液，4℃避光孵育16h，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤1次，静置30s，拍干，然后在每孔中加入200μl封闭液，37℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

8.根据权利要求1所述的一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法，其特征在于，建立黄曲霉毒素B1标准品标准曲线时选用的底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺。

9.根据权利要求8所述的一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法，其特征在于，终止液为2mol/L硫酸；洗涤液为含有0.01％吐温-20、3g/L叠氮化钠防腐剂、0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，pH为7.2；复溶液为0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，pH值为7.0。

10.一种检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，采用权利要求1-9中任一项所述的检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫检测方法。