[发明专利]一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法及其试剂盒

说明书

本发明涉及黄曲霉素B1检测技术领域，公开了一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法，包括以下步骤：将黄曲霉毒素B1抗抗体与辣根过氧化物酶进行偶联得到酶标记的黄曲霉毒素B1抗抗体；用包被缓冲液将包被黄曲霉毒素B1抗原稀释，注孔，避光孵育，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤，静置，拍干，然后在孔中加入封闭液，再避光孵育，倾去孔内液体拍干，干燥后得到酶标板，用铝膜真空密封保存；建立黄曲霉毒素B1标准品浓度相对吸光度的标准曲线，并根据该标准曲线由待测样品的吸光度推算出待测样品中的黄曲霉毒素B1含量；该方法在15min内显色，检测黄曲霉毒素B1变异系数在5.3‑8.5％之间，精密度较高；并提供采用该酶联免疫检测方法进行检测的试剂盒。

技术领域

本发明涉及黄曲霉素B1检测技术领域，具体涉及一种检测黄曲霉素B1的 酶联免疫检测方法及其试剂盒。

背景技术

黄曲霉毒素B1(aflatoxinB1称AFB1)是真菌的次级代谢产物，主要是由 黄曲霉(Aspergillusflavus)、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)和特曲霉(Aspergillusnomius)产生。它易天然存在于花生、棉籽、玉米、小麦和稻米等 农作物中，具有强烈的毒性和致癌性。

黄曲霉毒素B1的分子式为C₁₇H₁₂O₆，化学结构如下：

其结构中含有一个双呋喃环和一个香豆素，前者为基本毒性结构，后者与 其致癌性有关。黄曲霉毒素B1对雏鸭的半致死量仅为0.3mg/kg体重，其毒性 为氰化钾的10倍，砒霜的68倍。当食品、饲料及其相关制品保存不当极易受 到黄曲霉毒素B1的污染，黄曲霉毒素B1进入人体后，其主要靶器官为肝脏， 急性中毒症状为恶心、呕吐、胃肠大出血而死亡。慢性中毒主要会引起肝癌， 还可以诱发骨癌、肾癌、直肠癌等。目前，我国规定各种食物或饲料中黄曲霉 毒素B1的最高允许量根据来源不同为0.5～20.0μg/Kg。国际上AFT最大允许含量不断降低，2004年欧盟再次修订对婴儿和儿童食品中AFT的限量标准，包 括谷类食品在内的婴幼儿食品以及具有特殊医疗目的的婴儿食品，AFB1的最大 允许限量均为0.10ug/kg。现在黄曲霉毒素B1检测方法要求也在不断提高。

目前常用的方法有放射免疫分析法、荧光免疫分析法、酶联免疫分析法等。 其中，放射性免疫分析虽高灵敏、高特异性，但存在有效期短、具有放射性污 染的问题；荧光免疫分析法虽然特异性强、敏感性高、速度快，但非特异性染 色问题尚未解决，结果判定的客观性不足，程序也比较复杂。而酶联免疫法集 合了抗原抗体反应的高特异性与酶促反应的高度敏感性。这种方法灵敏度高， 比薄层法提高了近200倍；特异性强，荧光物质、色素、结构类似物对结果无 干扰；而且回收率高，提取方法简单，可进行定性定量测定。但目前黄曲霉毒 素B1的酶联免疫分析方法精密度较低。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种检测黄曲霉素B1的 酶联免疫检测方法，该方法在15min内显色，检测黄曲霉毒素B1变异系数在 5.3-8.5％之间，精密度较高，且测得黄曲霉毒素B2/G1/G2交叉反应率结果均小 于1％；并提供采用该酶联免疫检测方法进行检测的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种检测黄曲霉素B1的酶联免疫检测方法，包括以下步骤：

(1)以黄曲霉毒素B1单克隆抗体为免疫原对无病原体免疫动物进行免疫， 得到黄曲霉毒素B1抗抗体；

(2)将步骤(1)得到的黄曲霉毒素B1抗抗体与辣根过氧化物酶进行偶联 得到酶标记的黄曲霉毒素B1抗抗体；

(3)用包被缓冲液将包被黄曲霉毒素B1抗原稀释，注孔，避光孵育，倾 去孔中液体，用洗涤液洗涤，静置，拍干，然后在孔中加入封闭液，再避光孵 育，倾去孔内液体拍干，干燥后得到酶标板，用铝膜真空密封保存；