[发明专利]利用木糖生产原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌株及构建方法和应用

说明书

本发明利用木糖生产原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌株及构建方法和应用；以解脂耶氏酵母ATCC 201249为出发菌株，导入了优化的木糖还原酶XYL1、木糖醇脱氢酶XYL2以及过表达的内源的木酮糖激酶XKS表达盒，得重组菌株1；向重组菌1导入达玛烯二醇合酶基因DS，原人参二醇合酶基因PPDS及细胞色素P450还原酶基因ATR1，得重组菌株2；向重组菌株2导入截断的甲羟戊酸途径中编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸‑羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因tHMG1、鲨烯合酶的基因erg9和编码法尼烯焦磷酸合酶的erg20，得到重组菌株3。利用重组解脂耶氏酵母菌用木糖生产原人参二醇，摇瓶产量达到80.88mg/L。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及利用木糖生产原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌株及构建方法和应用。

背景技术

原人参二醇(Protopanaxadiol，缩写为PPD)是人参、红参等中药中的重要活性成分,是达玛烷型人参皂苷的前体。现代医学研究表明，PPD具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎症等生物活性，在冠心病，抗抑郁等方面也有出色的疗效。

由于人参中的PPD含量极少，不到人参干重的0.05％，因此，PPD的生产和制备主要来自于PPD型总皂苷的糖基水解、酶解获得，然而这类方法存在以下几个缺点。1)原料短缺。人参生长周期长，且易受到农药残留污染，导致产品品质无法满足国内外市场需求。2)人参提取物成分复杂，分离纯化成本较高。3)制备过程往往伴随着对环境的高污染。因此，利用合成生物学的方法，通过微生物发酵生产人参皂苷将从根本上解决上述问题。

解脂耶氏酵母作为一种GRAS(generally regarded as safe)非常规酵母，已有研究表明其适合作为萜类化合物生产底盘细胞。木糖是一种戊糖，是仅次于葡萄糖的木质纤维素水解产物中含量第二高的单糖。来源于林业、农业等的木质纤维素以及工业废料每年可达到1000亿吨，使这种生物质成为地球上最丰富的可再生资源，因此有效利用木质纤维素可有效的减少对能源和食物的需求。然而，由于碳分解代谢物的抑制作用，大多数微生物不能有效地从木质纤维素水解物中代谢木糖，这在很大程度上限制了木质纤维素的应用。因此，木糖的使用成为木质纤维素研究中的热点问题。在解脂耶氏酵母中已经有了许多使木糖作为底物的尝试。Ledesma-Amaro等设计了代谢木糖重组解脂耶氏酵母，成功得到了高达80g/L的柠檬酸。

然而，利用合成生物学方法在解脂耶氏酵母中代谢木糖来异源合成原人参二醇还未见报道。

发明内容

根据现有技术的复发展和目前存在的问题，本发明提出了利用木糖生产原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌株及构建方法和应用：

本发明的第一个目的是提供一种利用木糖生产原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌。

本发明的第二个目的是提供一种利用木糖生产原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法。

本发明的第三个目的是提供一种利用木糖生产原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌发酵生产原人参二醇的应用。

本发明的技术方案概述如下：

一种生产利用木糖生产原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌株的构建方法，其特征是是包括如下步骤：

(1)将优化的木糖代谢基因木糖还原酶基因XYL1表达盒和木糖醇脱氢酶基因XYL2表

达盒，以及内源的木酮糖激酶基因XKS表达盒，同时导入解脂耶氏酵母，得到重组菌1；

木糖还原酶基因XYL1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。木糖醇脱氢酶基因XYL2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。木酮糖激酶基因XKS的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。