[发明专利]一种基于深度测序的适用于HIV-1蛋白酶劣势耐药毒株检测方法

说明书

本发明公开了一种基于深度测序的适用于HIV‑1蛋白酶劣势耐药毒株检测方法。本发明提供了用于HIV PR耐药检测的引物组，由SEQ ID No.1‑6所示六条引物，以及分别在SEQ ID No.7和SEQ ID No.8的5’末端连接Barcode序列后所示两条引物组成。本发明中PR的cDNA合成和巢式PCR第一轮扩增在同一反应体系中完成；巢式PCR第二轮扩增中在引物的首尾加上Barcode序列；第二轮扩增产物纯化后进行高通量测序，从而获得HIV‑1PR劣势耐药毒株信息。本发明建立的新型HIV‑1蛋白酶劣势耐药毒株耐药检测方法，低成本、产出高。本发明对于艾滋病防治和公共卫生具有重大影响。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种基于深度测序的适用于HIV-1蛋白酶劣势耐药毒株检测方法。

背景技术

自1981年HIV被发现，其在全球迅速蔓延，先后导致近3,700万人感染，在全球引发了严重的公共卫生问题。为了响应WHO提出的3个90％的防治目标，抗病毒治疗(ART)作为一种防控手段在全球广泛推广应用，该手段有效地延缓了HIV感染者的疾病进程，控制了艾滋病的快速蔓延。截止到目前，全球已经有超过2,100万HIV感染者接受了ART，对于感染者体内病毒抑制和免疫重建起到了积极作用。中国近年来快速扩大治疗，目前已有超过50万HIV感染者接受了免费ART，为改善艾滋病患者生命质量、延长生命周期、减少艾滋病的传播都贡献了力量。

随着ART的广泛应用，HIV耐药性问题逐步凸显，已经成为艾滋病防控和治疗领域的关键问题。HIV耐药性是病毒、药物和宿主共同作用的结果。在药物选择压力下，HIV耐药毒株被筛选出来并逐渐发展成为优势毒株，临床表现为药物敏感性降低和/或病毒学反应不理想，最终影响ART的治疗效果。耐药导致ART失败的报道层出不穷，如在某些开展ART地区进行的耐药监测显示，约有50％患者经历免疫学失败，继而HIV耐药性毒株出现并快速流行；某些地区，针对一线药物的耐药性毒株的流行率已超过50％，并且新诊断人群传播性耐药亦呈快速上升趋势。HIV耐药毒株的传播与流行为艾滋病的防控也带来了前所未有的困难。

越来越多的证据表明，HIV-1感染者体内存在的劣势耐药毒株对抗病毒治疗效果有显著的影响，并且劣势耐药毒株常常是传播的原发耐药毒株的存在形式。习惯上我们将基于群体测序(population-based sequencing)未能检测到的、携带有导致对药物敏感性下降的突变位点的变异/突变毒株称之为劣势耐药毒株(Minor HIV-1Drug ResistanceStrains)，这些毒株在体内庞杂的HIV-1准种家族中所占比例往往不到20％，而这些少量存在的劣势耐药毒株在药物选择压力与趋利避害进化过程中发展成为优势毒株，最终导致抗病毒治疗的失败。如何在抗病毒治疗前了解患者本底耐药情况、体内劣势耐药毒株存在情况，对指导后期的抗病毒治疗具有重要的指导意义；如何为抗病毒治疗失败患者选择切实可行的后期治疗方案，劣势耐药毒株的检测对方案的选择也是大有裨益。检测艾滋病患者体内劣势耐药毒株并将这一检测结果应用于艾滋病的防控已成为全球共识。在抗病毒治疗领域，发现未治疗人群中存在的劣势耐药毒株会增加治疗失败的风险，即使劣势耐药毒株所占份额不足1％，它也会使得病毒学抑制失败的风险增加2.5倍左右；越来越多的数据证明，多数抗病毒治疗的失败与基线水平存在的劣势耐药毒株有关。通过对传播性耐药(transmitted drug-resistance,TDR)的研究，多数TDR传给未经抗病毒治疗的个体时以劣势毒株形式存在，而常规方法往往又无法检测到这一低水平的劣势耐药毒株，这为TDR的防控带来了困难。此外，HIV劣势耐药毒株亦是HIV-1准种家族的一份子，该毒株在患者体内如何进化也是一个备受关注的问题。