[发明专利]一种(R)-3-羟基丁酸的制备方法

说明书

本申请公开了一种(R)‑3‑羟基丁酸的制备方法。以聚‑β‑羟丁酸为底物，按质量比2～2.2％的比例加入活化的菌，得到混合酶液，将上述混合酶液接入扩增培养基中，静置培养1h，替换60％体积的扩增培养基，在溶氧3.0～3.2mg/L、温度32～35℃的条件下，培养20～24h，每3h替换60％体积的扩增培养基；扩增后的混合酶液，按1:2的体积比加入发酵培养基，在溶氧4.5～4.8mg/L、温度28～32℃的条件下进行好氧发酵，发酵过程中补入O₂和CO₂，培养40～72h，即得。本发明与化学合成法相比，效率高、不产生三废，是一种绿色、安全、简易的制备方法。

技术领域

本申请涉及生物合成技术领域，具体而言，涉及一种(R)-3-羟基丁酸的制备方法。

背景技术

3-羟基丁酸(3-HB)是哺乳动物肝脏内长链脂肪酸的主要代谢产物，是酮体家族的重要一员，存在于血浆和外周组织中。当机体处于长时间饥饿状态或因过度运动导致葡萄糖功能不足时，3-羟基丁酸可直接为大脑提供能量。

此外，3-羟基丁酸还被认为可用来治疗多种疾病，例如神经细胞保护、减少辅酶Q的氧化损伤、癌症(如脑癌)、葡萄糖代谢紊乱等。体内3-羟基丁酸以(R)-3-羟基丁酸的光学异构体存在，最近的研究表明，(R)-3-羟基丁酸的效用远优于(S)-3-羟基丁酸。

目前，(R)-3-羟基丁酸主要由化学法合成，效率低、成本高、三废高，部分工艺还要用到金属和高压氢化等条件。这些因素极大地限制的了(R)-3-羟基丁酸的使用。因此，寻找绿色、安全、简易、高效的合成方法显得十分迫切。。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种发酵法制备(R)3-羟基丁酸的方法，

本发明提供了一种(R)-3-羟基丁酸的制备方法，按照如下步骤进行：

以聚-β-羟丁酸为底物，按质量比2～2.2％的比例加入活化的菌，得到混合酶液，将上述混合酶液接入扩增培养基中，静置培养1h，替换60％体积的扩增培养基，在溶氧3.0～3.2mg/L、温度32～35℃的条件下，培养20～24h，每3h替换60％体积的扩增培养基；扩增后的混合酶液，按1:2的体积比加入发酵培养基，在溶氧4.5～4.8mg/L、温度28～32℃的条件下进行好氧发酵，发酵过程中补入O₂和CO₂，培养40～72h，即得。

具体的，所述的活化的菌为枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳酸发酵短杆。进一步的，本发明所述的活化的菌优选为谷氨酸棒杆菌。该菌种具有将丙酮酸和辅酶A转化为乙酰-CoA，将乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA，将乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸，并将乙酰乙酸转化为(R)-3-羟基丁酸的能力。

具体的，所述的扩增培养基为：酵母粉4～6g/L，蛋白胨8～10g/L，氯化钠8～10g/L，微量元素溶液1～1.2ml/L，pH为7.2～7.3。所述的微量元素溶液含有：硫酸锰1.4g/L、乙二胺四乙酸二钠1.0g/L、硼酸0.8g/L、硫酸铜0.2g/L、硫酸锌0.2g/L、硅酸钠0.2g/L、氯化钴0.1g/L、钼酸钠0.05g/L、硫酸镍0.05g/L。

具体的，所述的发酵培养基为：4～4.5g/L亚磷酸二氢钾、3.5～3.6g/L硫酸铵、1.2～1.3g/L硫酸镁、2～2.2g/L氯化铵、1～1.2g/L柠檬酸、0.090～0.11g/L氨苄青霉素、40～45g/L葡萄糖和1～1.2ml/L微量元素溶液，pH为6.9～7.0。所述的微量元素溶液含有：三氯化铬0.8g/L、硫酸铁0.5g/L、氯化钴0.3g/L、氯化钙0.1g/L、硫酸锌0.1g/L、硫酸铜0.06g/L、硫酸锰0.03g/L。