[发明专利]一种表达血清4型禽腺病毒纤突蛋白F2的重组杆状病毒的构建方法

权利要求书

1.一种表达血清4型禽腺病毒纤突蛋白F2的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）构建FAdV-4-F2基因重组杆状病毒表达载体；

设计F2基因扩增引物、pFastBacHTA线性化载体扩增引物，F2基因扩增引物扩增F2基因，pFastBacHTA线性化载体扩增引物扩增pFastBacHTA线性化载体，并连接转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂于加有Amp+的LB琼脂平板，过夜培养，利用菌落PCR鉴定阳性克隆，构建重组质粒pFastBacHTA-FAdV-4-F2；

F2基因扩增引物序列为:

上游引物:TTCAAAGGCCTACATGCTCCGGGCCCCTAA;

下游引物: CTCTAGATTCTTACGGGAGGGAGGCC；

pFastBacHTA线性化载体扩增引物序列为:

上游引物: TAAGAATCTAGAGCCTGCAGTCTCGAG;

下游引物: CATGTAGGCCTTTGAATTCCGCGCGCTTCG;

（2）表达重组FAdV-4蛋白的杆状病毒包装和传代；

将构建成功的pFastBacHTA-FAdV-4-F2质粒转化进DH10Bac感受态细胞，利用蓝白斑筛选技术获得重组的阳性克隆；挑取单克隆，37℃过夜扩大培养后，提取重组的带有F2基因的杆状病毒基因组，同时取不含目的片段的杆状病毒转移载体质粒作为阴性对照；利用pUC/M13 Forward和pUC/M13 Reverse引物，PCR扩增验证杆状病毒基因组；

（3）将携带有FAdV-4-F2基因的杆状病毒基因组转染进sf9细胞，27℃培养箱中培养5-7天，观察细胞病变情况；当细胞病变达到70%时收集细胞裂解液，离心去沉淀，作为种毒保存；进行病毒的传代，传至第3代时，作为种毒扩大培养。