[发明专利]一种表达血清4型禽腺病毒纤突蛋白F2的重组杆状病毒的构建方法

说明书

本发明涉及一种表达血清4型禽腺病毒纤突蛋白F2的重组杆状病毒的构建方法，包括以下步骤：（1）构建FAdV‑4‑F2基因重组杆状病毒表达载体；（2）表达重组FAdV‑4蛋白的杆状病毒包装和传代；（3）将携带有FAdV‑4‑F2基因的杆状病毒基因组转染进sf9细胞，27℃培养箱中培养5‑7天，观察细胞病变情况；当细胞病变达到70%时收集细胞裂解液，离心去沉淀，作为种毒保存；进行病毒的传代，传至第3代时，作为种毒扩大培养。本发明利用杆状病毒表达系统构建了含F2基因的重组杆状病毒穿梭载体，将其转染Sf9细胞后获得重组杆状病毒rBA‑F2，通过间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot鉴定重组蛋白F2的表达。

技术领域

本发明涉及一种表达血清4型禽腺病毒纤突蛋白F2的重组杆状病毒的构建方法，属于生物技术领域。

背景技术

禽腺病毒(Fowl Adenovirus，FAdV)属于腺病毒科禽腺病毒属，分为5个种(A-E)，12个血清型。其中FAdV-4可通过接触水平传播及垂直传播,对雏鸡的致病力最强，致死率高，发病的宿主包括白羽肉鸡、肉种鸡、蛋鸡、黄羽鸡。临床表现为包涵体肝炎(IBH)、心包积水肝炎综合征(HHS)。随着我国养鸡业的迅速发展，禽腺病毒的爆发给家禽业造成了严重的经济损失。而F2蛋白是FAdV-4的衣壳蛋白之一，F2蛋白具备很好的抗原性,被认为与FAdV-4的组织嗜性有关，且能有效刺激机体产生中和抗体。由于目前尚无快速特异检测FAdV-4的血清学方法及商品化FAV-4疫苗。为减少FAdV-4给我国禽行业带来的损失，进一步研究建立诊断方法和生产FAdV-4亚单位疫苗及快速诊断试剂，本发明通过构建含FAdV-4-F2蛋白的重组杆状病毒载体，并利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达了F2蛋白，为建立及生产安全、可靠、适合推广的FAdV-4血清学检测方法和亚单位疫苗奠定了基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种表达血清4型禽腺病毒纤突蛋白F2的重组杆状病毒的构建方法。本发明的原理是通过扩增禽腺病毒血清4型的纤突蛋白F2全长片段，构建杆状病毒重组载体，转染Sf9细胞，获得能够表达纤突蛋白F2的杆状病毒。间接免疫荧光试验(IFA)和免疫印迹试验(Western-blot)结果显示,在Sf9细胞中扩增的含有F2蛋白的重组杆状病毒能够与鼠抗F2蛋白单克隆抗体发生特异性反应。

本发明的目的是这样实现的，一种表达血清4型禽腺病毒纤突蛋白F2的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建FAdV-4-F2基因重组杆状病毒表达载体；

设计F2基因扩增引物、pFastBacHTA线性化载体扩增引物，F2基因扩增引物扩增F2基因，pFastBacHTA线性化载体扩增引物扩增pFastBacHTA线性化载体，并连接转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂于加有Amp+的LB琼脂平板，过夜培养，利用菌落PCR鉴定阳性克隆，构建重组质粒pFastBacHTA-FAdV-4-F2；

F2基因扩增引物序列为:

上游引物:TTCAAAGGCCTACATGCTCCGGGCCCCTAA；

下游引物:CTCTAGATTCTTACGGGAGGGAGGCC；

pFastBacHTA线性化载体扩增引物序列为:

上游引物:TAAGAATCTAGAGCCTGCAGTCTCGAG；

下游引物:CATGTAGGCCTTTGAATTCCGCGCGCTTCG；

(2)表达重组FAdV-4蛋白的杆状病毒包装和传代；