[发明专利]一种呼吸道感染用快速鉴定试剂盒及其鉴定方法

权利要求书

1.一种呼吸道感染用快速鉴定试剂盒，其特征在于：所述试剂盒通过如下步骤制得：

步骤一：制备抗体；

步骤二：胶体金标记抗体：

1)胶体金和抗体的结合：

用K₂CO₃和氯化氢溶液调节pH至蛋白质沉淀点，将待标记的抗体依次稀释后，分别与胶体金胶体液混匀3～5min后，加入1ml的质量分数为10％的氯化钠溶液迅速混匀，放置5min-2h，在580m波长时测定其光密度，确定抗体稳定胶体金的最小浓度，接着将10％体积的蛋白质溶液加于胶体金溶液中，反应5～7min后加入牛血清白蛋白并调整至pH8.5，放置室温继续反应；

2)胶体金抗体复合物的分离纯化：

采用高速离心法进行纯化，以去除未参与标记的过量的抗体、未完全稳定的胶体金颗粒以及各种可能形成的聚合物，离心的温度为4℃，离心的时间为30分钟，离心转速为10000rpm/min，离心后得上清液一和沉淀物一，取出上清液一重复上述离心操作，离心的温度为4℃，离心的时间为30分钟，离心转速为10000rpm/min，二次离心后得上清液二和沉淀物二，摒弃上清液二，用与沉淀物二等体积的0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液重新悬浮，并重复离心操作，离心的温度为4℃，离心的时间为30分钟，离心转速为10000rpm/min，三次离心后得上清液三和沉淀物三，摒弃上清液三，取沉淀物三，用沉淀物三的0.01倍体积的0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液与沉淀物三重新悬浮，并使用0.45μm滤膜过滤除菌，随后在4℃的环境下保存；

3)胶体金标记抗体的鉴定：

通过胶体金颗粒的水溶液颜色和在波长510～50m之间最大吸光值的检测，反映胶体金颗粒的形状和大小，将金标免疫原溶液滴入有支持膜的镍网，自燃干燥，电镜下观察胶体金颗粒的大小及均匀度，计算100个颗粒的平均直径，随后使用免疫细胞化学滤纸模型鉴定胶体金标记抗体的特异性和敏感性，最后加入稳定剂，冷冻保存；

4)胶体金标记抗体的活性测定：

采用斑点酶联免疫吸附测定法，取降钙素原、肺炎支原体或白色念珠菌分点样于硝酸纤维素膜上，自然晾干后放入96孔板中，每孔加摩尔浓度为0.01的磷酸盐缓冲溶液，在37℃的温度下封闭1小时，用磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，每孔加入100μL金标抗体液，在37℃的温度下静置1小时，取出硝酸纤维素膜，观察显色结果。

步骤三：试纸卡组装：采用免疫层析法，制备胶体金免疫层析试纸条；

步骤四：胶体金标抗体的验证：将降钙素原、肺炎支原体和白色念珠菌作为胶体喷点于检测垫上，将胶体金标记降钙素原抗体、肺炎支原体特异性P1蛋白抗体和白色念珠菌特异的细胞壁甘露聚糖抗体喷点在金标结合垫上，跑样10分钟，确定金标抗体的反应性。

步骤五：夹心抗体抗体验证：按照试纸条组装步骤，抗原喷点在检测垫上，并将胶体金标抗体喷点到胶体金结合垫上，将病原微生物抗原的磷酸盐缓冲溶液滴涂到样品垫上，跑样10分钟，根据检测区域现象确定夹心可行性。

步骤六：灵敏度优化：优化包被抗原、金标抗体、缓冲溶液浓度和作用时间，确定特异性检测抗原的最高灵敏度。

步骤七：加速稳定性测试：通过37°破坏性试验检测试剂作用于胶体金试纸条，检测其表现，同时在4°时留样以备长期检测。

2.根据权利要求1所述的一种呼吸道感染用快速鉴定试剂盒，其特征在于：所述步骤一中分别以降钙素原、肺炎支原体灭活菌体、细胞壁甘露聚糖为抗原与弗氏完全佐剂乳化，连续3次免疫白变种实验室小鼠，间隔2周，选取抗体效价大于1:10000的小鼠进行腹腔冲击免疫，免疫后第3天，取小鼠脾脏；随后取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞在聚乙二醇融合剂作用下进行细胞融合形成杂交瘤；接着将杂交瘤细胞经换液培养3次后，以浓度为1.0×10⁶个/mL的细胞，用磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，腹腔注射白变种实验室小鼠，每天观察小鼠生长状态，待小鼠腹部肿胀，行动迟缓时腹腔抽取腹水；将小鼠腹水按1:100、1:200、1:300、1：400、1:500、1:600、1:700的7个浓度系列配比稀释，采用酶联免疫吸附剂测定的方法检测抗体效价。