[发明专利]一种表达细胞免疫疫苗mRNA的质粒载体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种表达细胞免疫疫苗mRNA的质粒载体及其构建方法和应用。该质粒载体包括能够在待插入表达的细胞免疫疫苗位点(T抗原表位)肽段基因前部5’‑端的：血红蛋白β亚基基因(HBB)的5’‑非翻译区、人类白细胞抗原组织相容性复合体B基因(HLAB)蛋白信号肽序列；以及基因后部3’‑端的：HLAB蛋白MITD结构域编码序列、HBB基因的3’‑非翻译区、和长度为60的Poly(dA)尾部序列。本发明构建的体外表达mRNA的质粒载体，可以直接将T抗原表位位点插入到表达目标蛋白基因中，表达的mRNA携带有长度为60的poly(A)尾部序列，可直接高效翻译为能在哺乳动物体内或体外培养细胞中表达定位到细胞表面的T抗原表位。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术、细胞培养、免疫生物学和图像分析等技术领域。具体而言，包括通过酶切、连接等方式将带有T7 RNA聚合酶结合位点、翻译表达所需关键元件、细胞表面定位所需关键元件替换已有表达质粒中原来的可替换区段，构建为一种可在哺乳动物体内或体外培养细胞中表达mRNA的质粒载体pNeoCura-TVac；随后将5个细胞免疫疫苗抗原位点(简称T抗原表位)用接头序列间隔构建为基因片段，插入此载体中构成示例质粒，将此示例质粒转化入适当的大肠杆菌菌株、培育后提取质粒、在体外进行酶切线性化、转录得到示例mRNA；并检测此示例mRNA浓度和纯度，评估此类载体所表达mRNA的能力。

背景技术

在疫苗位点筛选及疫苗制药技术中，核酸疫苗特别是mRNA疫苗是其中分子疫苗最新发展的领域。mRNA疫苗具有理化性质统一、方便使用统一方案流程制备和大规模高通量筛选有效疫苗抗原位点的特点，呈现出比传统疫苗(灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗)和其它现代分子疫苗(重组蛋白疫苗、病毒载体疫苗)开发流程更为方便高效的优势。而其中可激活人体T细胞特异免疫应答的细胞免疫疫苗抗原位点(简称“T抗原表位”)，更是可以采用将多达5个T抗原表位及相关接头序列整合到一个mRNA表达载体、一次性进行免疫活性检测和筛选的策略。

信使核糖核酸(mRNA)是真核生物基因表达的重要一环，在DNA-(转录)-mRNA、mRNA-(翻译)蛋白的中心法则中处于居中的重要地位。成熟mRNA由5’-帽、5’-非翻译区域(5’-UTR)、蛋白编码序列(CDS)、3’-非翻译区域(3’-UTR)、3’-多聚腺苷核酸(3’-poly(A))尾部组成。其中5’-UTR和3’-UTR对mRNA在体内或培养细胞系内的稳定性起到重要作用，而CDS中特定的信号肽和相关结构域等对mRNA翻译所得的蛋白的亚细胞定位起着决定作用。T抗原表位需要在翻译表达为对应肽段后定位到细胞表面，才能引发细胞免疫应答反应。

目前在分子生物学领域，缺乏适当的学术用或商用可在哺乳动物细胞表面表达T抗原表位的质粒载体。

发明内容

在mRNA分子疫苗靶位点筛选包括T抗原表位筛选中需要适当的体外转录表达载体。目前尚无此类载体得到广泛使用。本发明的目的是在已有可得到体内或细胞内稳定性和翻译表达能力的mRNA的表达载体的基础上，改造为能够在转录同时添加保持mRNA稳定性和翻译表达能力、且带有T抗原表位所需细胞表面定位序列的质粒载体，并确定其可通过体外转录得到高浓度与高纯度的对应mRNA。

具体来说，本发明使用限制性内切酶XbaI和XhoI将pNeoCura-Exp060载体中长度为30的可替换区段移除，并连接插入一段带有XbaI位点粘性末端、T7 RNA聚合酶识别片段、来自血红蛋白β亚基(HBB)基因的5’-非翻译区(5’-UTR)序列、人类白细胞抗原组织相容性复合体B(HLAB)蛋白的信号肽序列、编码接头肽段(GGSGG)的序列并且其中编码GS两个连续氨基酸的正好是BamHI位点、编码3xFLAG-HA标记的可移除序列、编码接头肽段(GGSGG)的序列并且其中编码SG两个连续氨基酸的正好是BspEI位点、HLAB蛋白的MITD结构域编码序列、来自HBB的3’-非翻译区(3’-UTR)序列、XhoI位点粘性末端的人工合成序列，构建为pNeoCura-TVac质粒载体。