[发明专利]一种农杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化方法，其特征在于：包括：

步骤1、外植体筛选，消毒及无菌培养；

步骤2、农杆菌侵染液的制备；

步骤3、木豆全株真空渗透；

步骤4、叶片与根部鉴定；

步骤1外植体筛选，消毒及无菌培养的具体步骤包括：

步骤1.1、木豆选用已有全基因组测序数据的品种“ICPL87119”，木豆种子挑选颗粒饱满匀称，状态健康的种子，以提高出苗率和降低染菌率；

步骤1.2、采用次氯酸钠消毒法对筛选出的木豆种子进行消毒；

步骤1.3、在超净台中将消毒后的木豆种子接种于MS固体培养基中，然后置于人工培养室条件下生长，等待生长20-30天，挑选健壮且生长一致的木豆植株，备用；

步骤1.2中具体的消毒过程为：75％酒精消毒30秒，再用次氯酸钠消毒6分钟，最后用无菌水冲洗5次；

步骤1.3中木豆种子消毒后萌发到成苗的阶段都是在人工培养室的组培瓶中进行，保证无菌环境；

待侵染的木豆苗选用培养生长25天木豆苗作为材料的转基因成功率最高。

2.如权利要求1所述的农杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化方法，其特征在于：步骤2农杆菌侵染液制备的具体步骤包括：

步骤2.1、将包含有植物过表达载体35S-eGFP-pROK2的农杆菌GV3101于YEP+Rif+Kana固体培养基上划线接种，置于28℃培养箱倒置培养48h；

步骤2.2、挑单菌落于5mL YEP+Rif+Kana液体培养基中，置于28℃摇床培养12h，转速200rpm；

步骤2.3、将5mL菌液转入150mL YEP+Rif+Kana液体培养基中，置于28℃摇床培养6h，转速200rpm，使OD600吸光值在3-5之间；

步骤2.4、5000rpm离心10分钟，去上清后沉淀重悬于300mL普通MS液体培养基中，使OD600吸光值在0.3-2.4之间，备用。

3.如权利要求2所述的农杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化方法，其特征在于：步骤2.1中所述的包含有植物过表达载体35S-eGFP-pROK2的农杆菌GV3101是通过常规GV3101农杆菌冻融法将35S-eGFP-pROK2质粒转入农杆菌GV3101感受态获得的；

YEP+Rif+Kana培养基指具有100mg/L硫酸卡那霉素和500mg/L利福平的YEP培养基。

4.如权利要求2所述的农杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化方法，其特征在于：木豆叶片部位瞬时转化测定时，农杆菌侵染液选择OD600＝1.2；木豆根部稳定转化测定时，农杆菌侵染液选择OD600＝2.4。

5.如权利要求2所述的农杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化方法，其特征在于：步骤3木豆全株真空渗透的具体步骤包括：

步骤3.1、将状态良好的木豆植株浸没于农杆菌侵染液中，在0.03-0.09MPa真空压力条件下侵染5分钟；

步骤3.2、真空侵染后洗苗，于滤纸上除去表面水分，最后置于含有100mg/L头孢素的MS培养基中；

步骤3.3、将侵染后的木豆植株置于人工培养室条件下生长10至15天，在茎下部发出新根；

步骤3.4、侵染后的木豆植株在培养3-7天之间取叶片部位用于基因瞬时表达的快速鉴定。

6.如权利要求5所述的农杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化方法，其特征在于：

步骤3.1中，木豆根部稳定转化测定时，压力值设定在0.07MPa，木豆叶片部位瞬时转化测定时，压力值设定在0.05MPa；

步骤3.2中所述洗苗是为了除去植物表面在瞬转时残留的农杆菌，具体操作为：先用无菌水洗一次，125mg/L头孢抗性无菌水洗一次，最后无菌水洗三次；

步骤3.4中真空侵染后叶片部位的取样时间在培养5天，此时是木豆苗状态最好且基因表达量最高的时间段。

7.如权利要求5所述的农杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化方法，其特征在于：所述的人工培养室条件为温度25±2℃，光照16小时，黑暗8小时的循环周期。

8.如权利要求5所述的农杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化方法，其特征在于：步骤4叶片与根部鉴定的具体步骤包括：

步骤4.1、取步骤3.4中所述的培养3-7天后的木豆叶片组织冻于液氮中，用CTAB法提取RNA，反转录为cDNA后用荧光定量方法鉴定基因表达量变化；

步骤4.2、将步骤3.3中所述生长10至15天后发出新根的木豆植株截去旧根，置于新的MS培养基中继续生长；或者将步骤3.3中所述生长10至15天后发出新根的木豆全株移栽到育苗土中，等待新根生长茁壮后再除去旧根；

步骤4.3、待新根生长一段时间后，剪取部分分生的侧根冻于液氮中，待DNA检测鉴定；

步骤4.4、将步骤4.3中获得的根部组织用CTAB法提取DNA，用35S+eGFP基因的全长引物进行PCR扩增，若PCR扩增出大小为720bp的目的条带，且测序结果比对为35S+eGFP基因序列，而未侵染的木豆植株根部未能扩增出任何条带，表明茎下部发出的新根为转基因不定根；

步骤4.2中所述新的MS培养基是指添加50mg/L头孢素的MS培养基，且在培养基冷却但未凝固时将剪去旧根的发出新根苗移入。