[发明专利]一种农杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化方法

说明书

本发明涉及一种农杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化方法，属于分子生物学与植物转基因工程技术领域。本发明的实验步骤主要分为四个部分：外植体筛选；农杆菌侵染液制备；木豆全株真空渗透，转基因鉴定。本发明不仅可以获得由茎部诱导出的稳定转基因根系，且木豆的叶片部分经过瞬时转染可用于基因表达的快速鉴定。本发明首次发现木本植物幼苗可通过农杆菌真空渗透在茎部出转基因根。该方法不仅可以直接运用于木豆的遗传转化，同时为木本植物的遗传转化体系提供了新的思路。

技术领域

本发明属于分子生物学与植物转基因技术领域，具体地涉及一种利用农杆菌介导真空侵染木豆植株的高效遗传转化方法及其应用，能够获得稳定转化的转基因根和瞬时转化的叶片。

背景技术

木豆原产于印度，是世界第六大食用豆类，是半干旱地区主要的经济作物，具有较高的营养价值和药用价值。近年来，随着木豆的药用价值不断被开发，种植范围也不断扩大。以传统方法栽培木豆已经无法满足市场需求，如何通过分子手段培育高产量高质量的木豆成为人们关注的问题，同时相关的科学研究也在不断展开。然而相比于水稻，玉米，大豆等草本植物，木豆作为木本植物，要通过组织细胞的遗传转化方法一直都是基因工程中的难点。目前关于木豆遗传转化方法的报道极少，本发明主要借鉴了大豆等相近物种的遗传转化方法。在此前，有利用发根农杆菌K599介导真空渗透大豆种子下胚轴而获得转基因毛状根的遗传转化方法。但该方法存在转化根和正常根同时存在，不好区分的问题。而本发明不仅可以在木本植物中获得转化根，同时可以排除原始根的干扰。本发明的优势还在于无菌条件下高效快速的获得大量转基因根组织，以及保留复合体转基因木豆植株。该方法是用农杆菌侵染木豆全株，因此地上部分的基因瞬时表达可以应用于基因功能的快速验证。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效、快速、稳定的农杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化方法，通过木豆种子筛选，无菌培养长成茁壮木豆苗后，取木豆全株浸没于农杆菌侵染液中，在压力条件下进行真空侵染；侵染过后洗苗移栽到新的抗性MS培养基中培养，等待在茎部长出新根；待出新根后剪去旧根，洗苗移栽至新的MS培养基等待转基因新根生长；或待长出新根后直接全株移栽至育苗土中，等待新根生长茁壮后再截去旧根。与此同时，运用相同的真空侵染方法后培养3-7天的木豆苗的叶片可用于基因表达量的验证。同时该方法的优点还包括操作步骤简单，并能够获得无菌的转基因材料，解决木豆遗传转化周期长，效率低等问题，该方法可以跳过愈伤再生等步骤，直接由茎部获得转基因根系，同时地上部分可用于基因瞬时表达的快速验证。

为实现上述目的，改善目前木豆遗传转化技术的薄弱现状，本发明所采取的技术方案具体如下：

一种农杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化方法，包括：

步骤1、外植体筛选，消毒及无菌培养；

步骤2、农杆菌侵染液的制备；

步骤3、木豆全株真空渗透；

步骤4、叶片与根部鉴定。

在上述方案的基础上，步骤1外植体筛选，消毒及无菌培养的具体步骤包括：

步骤1.1、木豆选用已有全基因组测序数据的品种“ICPL87119”，木豆种子挑选颗粒饱满匀称，状态健康的种子，以提高出苗率和降低染菌率；

步骤1.2、采用次氯酸钠消毒法对筛选出的木豆种子进行消毒；

步骤1.3、在超净台中将消毒后的木豆种子接种于MS固体培养基中，然后置于人工培养室条件下生长，等待生长20-30天，挑选健壮且生长一致(株高相近，具有5片叶片的时期)的木豆植株，备用。

在上述方案的基础上，步骤1.2中具体的消毒过程为：75％酒精消毒30秒，再用次氯酸钠消毒6分钟，最后用无菌水冲洗5次。

在上述方案的基础上，步骤1.3中木豆种子消毒后萌发到成苗的阶段都是在人工培养室的组培瓶中进行，保证无菌环境；