[发明专利]一株无痕删除桔青霉素合成基因的红曲霉工业菌株

权利要求书

1.一种基因工程改造的红曲霉的制备方法，其特征在于以野生型红曲霉为原料，具体包括以下步骤：

提取野生型红曲霉基因组DNA；

根据野生型红曲霉桔青霉素生物合成基因簇上下游序列设计扩增up和down片段的引物：以红曲霉的基因组DNA为模板，cit-up-F/R和cit-dn-F/R分别做为引物扩增得到pKL-03质粒上的up和down片段；Pgpda-F/sgRNA-R和sgRNA-F/TtrpC-R以pFC333质粒为模板扩增得到组装pKL-05质粒所需的片段sgRNA-1和sgRNA-2；

提取pFC-333和pUC-57载体；

pFC333载体使用BglII和PacI两种内切酶酶切；

pUC57载体使用EcoRI和HindIII双酶切；

回收酶切后的载体和目的片段；

酶切后的pFC-333和pUC-57载体与目的片段连接：pUC57载体和up以及down片段通过吉布森组装得到pKL-03质粒，酶切后的pFC333载体和sgRNA-1以及sgRNA-2通过吉布森组装得到pKL-05质粒；

制备野生型红曲霉原生质体；

将pKL-03和pKL-05质粒共同转化原生质体；

制备得到基因工程改造的红曲霉；

引物序列如下：

所述的一种基因工程改造的红曲霉，其删除了包含桔青霉素合成所有必需基因的整个生物合成基因簇；所删除的桔青霉素生物合成基因簇序列如SEQ ID NO.1所示；基因工程改造的红曲霉包含如SEQ ID NO.2所示的基因序列。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：吉布森组装体系如下：Gisbon溶液15uL，载体加片段共5uL，其中载体与片段摩尔比为1:1。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：野生型红曲霉原生质体的制作方法如下：

a. 将野生型红曲霉接种平板上，培养；

b. 接种到液体培养基中，培养；

c. 离心收集菌丝；

d. 加入酶解液摇床中培养；

e. 轻轻滴加等体积trapping buffer，离心，收集中间层的原生质体；

f. 加入STC buffer，离心，去除液体；

g. 加入STC buffer重悬。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述将pKL-03和pKL-05质粒共同转化原生质体，步骤如下：

a. 取pKL-03和pKL-05质粒，加入到原生质体中；

b. 加入60% PEG Solution，混匀；

c. 与不含抗性的PDA-Sorbitol培养基混合后，培养，在表面再倒一层含有100μg/mL潮霉素的PDA-Sorbitol培养基。