[发明专利]一株无痕删除桔青霉素合成基因的红曲霉工业菌株

说明书

本发明涉及一株不产桔青霉素的红曲霉工业菌株。通过CRISPR/Cas9介导的无痕敲除技术对红曲霉基因组上的桔青霉素生物合成基因簇完全删除，该方法不会在基因组中引入任何外源基因，由此获得的新菌株MP‑20完全丧失生产桔青霉素的能力。新菌株MP‑20的连续十次发酵结果显示产物中完全检测不到桔青霉素，且色素产量提高了2.33％。

技术领域

本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一株不产桔青霉素的基因改造的红曲霉菌株，并涉及该红曲霉菌株的制备方法及其应用。

背景技术

红曲霉是一种工业上重要的多核丝状真菌，能够生产天然有机的红曲色素，其混合物在亚洲国家被广泛用作食品着色剂。但是，红曲霉也会产生桔青霉素，这是一种霉菌毒素，由于抑制呼吸复合物III而具有肾毒性，极大地限制了红曲色素的应用。许多国家已经颁布了法规，以严格限制红曲霉及其相关食品中的桔青霉素含量。目前中国的工业红曲色素中桔青霉素含量普遍超标，严重影响产品出口。而且，随着人们对食品健康的愈发重视，降低红曲色素中桔青霉素的含量势在必行。

目前，在工业过程中减少桔青霉素的产量仍然依赖于传统方法，包括物理诱变、化学诱变以及优化培养条件等。但是，诱变所得菌株在遗传上是不稳定的，并且在连续的发酵过程中经常会恢复桔青霉素的产生。

此外，基因工程手段也被用于桔青霉素的消除。由于红曲霉是一种多核真菌，传统的基因编辑工具无法一次性删除细胞中所有多个拷贝基因，细胞内的桔青霉素生物合成基因没有完全删除，因此得到工程菌株是异核体，遗传是极端不稳定的，仍然检测到桔青霉素的生成。此外由于红曲霉体内存在多个备用基因或同工酶，敲除某些桔青霉素生物合成基因只会导致减少，而不能完全消除citrinin的产生。这些结果表明，为了永久和稳定地消除工业真菌中桔青霉素的产生，必须删除包含桔青霉素合成所有必需基因的整个生物合成基因簇。

发明内容

本发明的目的是通过无痕敲除技术获得一株不产桔青霉素的红曲霉工业菌株。

本发明经过实验发现，在红曲霉中，桔青霉素生物合成基因簇包括6个功能基因。首先，在聚酮合酶citS的催化下,一分子乙酰辅酶A(acetyl-CoA)与七分子丙二单酰辅酶A(malonyl-CoA)通过反复缩合和延伸形成聚酮前体，然后依次在水解酶citA、加氧酶citB、氧化还原酶citC和醛脱氢酶citD的作用下生成羧基衍生物，最后在短链脱氢酶citE的作用下脱水成环，生成桔青霉素。

本发明涉及一种红曲色素的制备方法，其特征在于通过发酵基因工程改造的红曲霉制备得到，所述红曲霉删除了包含桔青霉素合成所有必需基因的整个生物合成基因簇。

如上所述的制备方法，其特征在于发酵红曲霉过程中不产生桔青霉素。

本发明还涉及一种基因工程改造的红曲霉(Monascus purpureus)，其特征在于其删除了包含桔青霉素合成所有必需基因的整个生物合成基因簇。

如上所述的生物合成基因簇，包括编码生成聚酮合酶CitS、水解酶CitA、加氧酶CitB、氧化还原酶CitC、醛脱氢酶CitD和短链脱氢酶CitE。

如上所述的一种基因工程改造的红曲霉，其特征在于发酵红曲霉过程中不产生桔青霉素。

如上所述的一种基因工程改造的红曲霉，其特征在于所删除的桔青霉素生物合成基因簇序列如SEQIDNO.1所示。

如上所述的一种基因工程改造的红曲霉，其特征在于包含如SEQIDNO.2所示的基因序列。