[发明专利]一种利用发根农杆菌转化获得整株转基因木本植株的方法

说明书

本发明公开了一种利用发根农杆菌转化获得整株转基因木本植株的方法。本发明所述的方法是先将携带目的基因的普通或特定载体转入发根农杆菌中，再用活化的发根农杆菌菌液侵染预培养的木本植物组培苗，培养至植株长出转基因毛状根后，转至添加地塞米松或MdWUSCHEL1蛋白质的根芽转化预培养基中诱导根生芽，再经过扩繁生根从而获得整株转基因木本植株。通过本发明的方法得到转基因植株的转化效率高，不仅充分利用了木本植物自身的细胞全能性，促进转基因根向整株转基因植株的分化，并且成本低，该方法适用性广，可以用于各种木本植物的转基因培育，具有广阔应用前景。

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及一种利用发根农杆菌转化获得整株转基因木本植株的方法。

背景技术

利用发根农杆菌转化植物是一种传统的植物转基因方法。发根农杆菌中含Ri质粒，Ri质粒T-DNA的LB端含RolA、RolB、RolC、RolD四个生根相关基因，RB端含生长素、细胞分裂素和冠瘿碱三个合成基因。这几个与生根及激素相关基因的存在使发根农杆菌侵染植物后，植物在侵染成功部位长出不定根，该不定根具有可离体生长、生长速度快、无向地性等特性。

发根农杆菌菌株对不同植物的转化能力不同。而现有发根农杆菌成功转化的植物多为草本植物，如玉米、花生、菠菜、人参、苜蓿、菊花、雪莲等，且其中很多草本植物都易由转基因根系转化为整株转基因植株。但对于木本植物来说，不仅转化效率低，且转化成功的植物种类很少，目前仅有苹果、柑橘、喜树、具芒小檗等几种木本植物转化成功，而且成功由转基因根诱导为整株的也仅有柑橘。其中主要的原因的是木本植物脱分化效率较草本植物更为低下，细胞全能性差，根向芽分化难度大。

芽由顶端分生组织分化而来，而WUSCHEL1基因是顶端分生组织分化的决定性因素，它能够促进顶端分生组织的分化，进而促进芽的形成。WUSCHEL1基因也能使某些组织或器官在不添加任何外源激素的情况下诱导体细胞胚发生。虽然现有技术提到过通过注射带有目的基因的发根农杆菌的菌液的方法使已生根苗再长出新的转基因毛状根，但该发明中最终仍停留在获得转基因根系的阶段，并未获得整株转基因植株，而WUSCHEL1基因的特性对获得整株木本植株存在重要意义。

发明内容

本发明公开了一种利用发根农杆菌转化获得整株转基因木本植株的方法，本发明克服了传统植物转基因方法低效率、高成本的缺陷，将WUXCHEL1基因转入转基因植物中，提高了木本植物细胞全能性，促进转基因根向整株转基因植株的分化，并成功获得含有WUXCHEL1基因的整株转基因木本植株，提高了木本植物的转化效率。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种利用发根农杆菌转化获得整株转基因木本植株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将含有目的基因的表达载体转入发根农杆菌后并活化，得到含有目的基因的活化发根农杆菌菌液；

(2)将木本植物的组培苗放入继代培养基中，于25℃，16h光照/8h黑暗的条件下继代培养28-32天后，切掉愈伤团，转入生根培养基中，于25℃，16h光照/8h黑暗的条件下预培养4-6天，得到预培养组培苗；

(3)取出所述预培养组培苗，切掉愈伤组织，切口处蘸取所述含有目的基因的活化发根农杆菌菌液，然后吸干多余菌液得到侵染组培苗；

(4)将所述侵染组培苗放回生根培养基中，于28℃，24h黑暗的条件下培养1-2天后插到含有500mg/L特美汀的MS培养基中培养，直到长出转基因毛状根，得到转基因根系；

(5)待所述转基因根系的根长到5cm时切下，先转入根芽转化预培养基中，于25℃，16h光照/8h黑暗下培养5天后，再转入添加地塞米松或MdWUSCHEL1蛋白质的根芽转化预培养基中培养直至生芽，得到转基因地上部分转基因芽；