[发明专利]一种芋茎尖超低温保存方法

说明书

本发明公开了一种芋茎尖超低温保存方法。本发明公开的芋茎尖超低温保存方法包括：利用含有还原型谷胱甘肽的预培养液对芋茎尖进行预处理，得到预处理的芋茎尖；将预处理的芋茎尖于超低温环境中保存，实现芋茎尖的超低温保存；预培养液由溶质和溶剂组成，溶剂为MS液体培养基，溶质及其在预培养液中的浓度分别为0.1‑0.2mmol/L还原型谷胱甘肽和0.3mol/L蔗糖。利用本发明的芋茎尖超低温保存方法保存芋茎尖，芋茎尖的存活率可由23.13％提高至53.90％，再生率可由23.13％提高至49.49％。本发明的方法成本低廉、操作简便，是井冈山芋种质超低温保存的一条有效途径。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，一种芋茎尖超低温保存方法。

背景技术

芋(Colocasia esculenta L.Schott)，是天南星科芋属(Colocasia)多年生宿根性草本植物，是芋属植物的主要栽培种。芋喜湿，不耐干旱。芋的多样性极其丰富，主要生长于热带、亚热带地区，世界现存种质1万多份。在中国广泛栽培，其中生产面积较大的省份主要有福建、云南、广东、四川和浙江等。芋的地下球茎营养丰富，富含淀粉、蛋白质、多种维生素，脂肪含量低，是主要的食用部位，俗称芋头。芋是一种世界性的粮食兼蔬菜作物，抗逆性强、适应性广，在非洲、西印度、太平洋和亚洲地区的发展中国家，芋的球茎是人们主食淀粉的来源之一。

无性繁殖及多年生作物种质资源的保存可采用田间保存(field repository)、试管苗保存(in vitro conservation)和超低温保存(cryopreservation)等保存方式。芋目前主要采用田间保存和试管苗保存。田间保存(field repository)利于种质资源的分发利用，但长期反复种植易使一些病毒病病害广泛传播，造成许多优良品种种性退化、品质变劣，种植面积日益减少，甚至濒临绝种，如经芋花叶病毒侵染后，产量下降，品质降低，出现久煮不烂现象。一些野生芋种质资源也因环境的改变和人为因素的破坏而逐渐消失，这些严重威胁芋种质资源的安全保存。试管苗保存(in vitro conservation)方式占地面积小、不易受自然灾害和病原菌影响、便于种质交换，但因试管苗保存的材料仍处于生长状态，因此需要定期继代，且经多次频繁继代后易发生退化或变异等现象。

超低温保存(cryopreservation)，即植物组织材料经一系列的保存前处理后，投入液氮保存(气相液氮或液相液氮条件下)，经化冻复苏后仍能在一定培养条件下再生成植株，并保持其遗传稳定性。超低温保存方式既避免了田间保存易受自然灾害影响而导致种质变异或毁灭，也避免了试管苗保存中因多次继代引起遗传性状变异或污染的危险。衡量茎尖超低温保存方法成功在于，经超低温保存处理化冻后的茎尖在适宜条件下恢复培养后，可直接再生成正常苗，不经过愈伤阶段。目前芋种质已报道有标准玻璃化法、小滴玻璃化法、包埋玻璃化法超低温保存方法，但不同品种其存活率有很大差别。每个不同品种需要优化其最佳技术体系，以获得超低温保存后的较高成活率。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何对芋茎尖进行超低温保存。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种芋茎尖超低温保存方法，所述方法包括：利用含有还原型谷胱甘肽的预培养液对芋茎尖进行预处理，得到预处理的芋茎尖；将所述预处理的芋茎尖于超低温环境中保存，实现芋茎尖的超低温保存。

上述方法中，所述预培养液由溶质和溶剂组成，所述溶剂为MS液体培养基，所述溶质及其在所述预培养液中的浓度分别为0.1-0.2mmol/L还原型谷胱甘肽和0.3mol/L蔗糖。

上述方法中，所述预处理可在黑暗中进行。所述预处理的时间可为2天。所述预处理可在25℃进行。

上述方法中，将所述预处理的芋茎尖于超低温环境中保存可包括：