[发明专利]一种RT-LAMP法检测口蹄疫病毒的引物组和试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种RT-LAMP法检测口蹄疫病毒的引物组，所述引物组包括6条引物，分别为：两条外引物：正向外引物F3、反向外引物B3；两条内引物：正向内引物FIP、反向内引物BIP；两条环引物：上游环引物LF、下游环引物LB，其特征在于，所述6条引物具体序列如下：

正向外引物F3：5'-GACAAAAGYGACAAAGGTT-3'；

反向外引物B3：5'-TAAAGTGATCTGTAGCTTGG-3'；

正向内引物FIP：5'-CGTGCAAAGGAGAGGATAGCCTC-CYGATGTCACTTTCCTCAAAAG-3'；

反向内引物BIP：5'-GACCATACAGGAGAAGTTGA-AAGAGRCCCTGGAAGGGCTCRAA-3'；

上游环引物LF：5'-TAAAACCCAGTTCCATA-3'；

下游环引物LB：5'-CTCGCCGTCCACTCTGG-3'；

所述6条引物位于口蹄疫病毒高度保守的3D蛋白基因内，全基因组的7776-8050 bp处，所述序列如SEQ ID NO:1所示，其中所述反向外引物B3、反向内引物BIP和下游环引物LB为该基因片段的互补基因序列；

所述6条引物在所述全基因组的7776-8050 bp处的具体位置为：

正向外引物F3：7776bp～7794 bp；

反向外引物B3：8031bp～8050 bp；

正向内引物FIP：7899 bp～7921 bp 、7816 bp～7837 bp；

反向内引物BIP：7928 bp～7947 bp 、8001 bp～8023 bp；

上游环引物LF：7854 bp～7870 bp；

下游环引物LB：7962 bp～7978 bp。

2. 一种RT-LAMP法检测口蹄疫病毒的试剂盒，该试剂盒内包含RT-LAMP反应管、阳性对照样品、阴性对照样品、比色卡，其特征在于：所述RT-LAMP反应管内包括扩增反应体系和显色体系，扩增反应体系位于RT-LAMP反应管底部，显色体系位于RT-LAMP反应管管盖处；所述扩增反应体系中引物组为权利要求1所述的引物组；所述显色体系是用石蜡油封闭的荧光染料，所述荧光染料为PicoGreen；密封荧光染料的方式为：制备成品试剂盒时在RT-LAMP反应管管盖中滴加4μL PicoGreen，随后滴加15 μL石蜡油，把PicoGreen封闭于反应管管盖处。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，该试剂盒中引物组的正向外引物F3和反向外引物B3为外引物、正向内引物FIP和反向内引物BIP为内引物、上游环引物LF和下游环引物LB为环引物，其特征在于：所述外引物：内引物：环引物的摩尔含量比为1:8:2。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述扩增反应体系共23μL，具体包括：

10×等温扩增RT-LAMP反应液 2.5 μL，

8U/μL 的Bst 2.0 WarmStart DNA 聚合酶 1.0μL，

10 mmol的dNTP 混合液 3.5μL，

100 mmol的硫酸镁 1.0 μL，

5U的AMV 反转录酶 1.0 μL，

ddH₂O 3.0μL，

10μmol的正向外引物F3 0.5 μL，

10μmol的反向外引物B3 0.5 μL，

10μmol的正向内引物FIP 4.0 μL，

10μmol的反向内引物BIP 4.0 μL，

10μmol的上游环引物LF 1.0μL，

10μmol的下游环引物LB 1.0μL。