[发明专利]一种外植体粘附法高效提取增殖自体成纤维细胞的方法

权利要求书

1.一种外植体粘附法高效提取增殖自体成纤维细胞的方法，其特征在于，包含以下步骤：

（1）皮块及外周血获取：取已采集好的2周内未服用过阿司匹林、其他抗血小板及抗凝血作用的任何相关药物且无系统性疾病、无传染病和性病的健康者耳后或眼睑0.25cm²～1cm²皮块及外周血40ml～60ml；

（2）血小板血浆提取：外周血经离心后得到的血小板血浆；获取的外周血在22-24℃保存下6小时内进行血小板血浆提取后添加终浓度5-10wt.%DMSO冷冻保护剂保存于-80℃，使用前按CaCl₂溶液：血小板血浆的体积比1:9向血小板血浆中加入8-12wt.%CaCl₂溶液激活后添加到DMEM/F12培养基，使血小板血浆终浓度为1.0～3.0×10¹²plt/L；

（3）皮块洗涤：生理盐水漂洗皮块血水后，75%乙醇浸泡30S消毒，生理盐水漂净乙醇后剥离皮肤血管及结缔组织，将剩余的皮肤组织用生理盐水漂洗7遍彻底洗净皮肤组织块；

（4）培养瓶包被、接种：培养瓶采用5ug-10ug/ml纤维蛋白溶液2℃-8℃包被过夜使用，洗涤的皮块用无菌手术刀切成1mm³小块接种包被培养瓶中，组织块距离5mm，放置37℃ 5%CO₂培养箱孵育2-4h使组织粘附在瓶底；

（5）培养：在上述培养瓶中加入含大麦β-葡聚糖的DMEM/F12培养基，37℃ 5%CO₂培养箱培养；大麦β-葡聚糖终浓度为300ug-500ug/ml；

（6）换液：前期每隔三天更换相同的含大麦-β葡聚糖的DMEM/F12培养基，直至观察到组织周围有贴壁细胞生长后，更换含PRP的DMEM/F12培养基，PRP终浓度为1.0~3.0×10¹²plt/L；放置37℃、5%CO₂ 、2%-5%O₂培养箱培养；

（7）传代：每隔3天更换含PRP的DMEM/F12培养基，待细胞融合度达到80%时，生理盐水清洗2遍，0.05wt.%胰蛋白酶消化2min后加入等体积的DMEM/F12培养基终止消化，收集细胞，为P0代细胞，按10000个/cm²的密度进行传代；

（8）鉴定：利用流式检测方法对提取的人成纤维细胞表面标记物CD44^＋、CD29^＋、Vimentin^＋表达水平进行检测。