[发明专利]一种外植体粘附法高效提取增殖自体成纤维细胞的方法

说明书

本发明提供一种高效提取增殖自体成纤维细胞的方法，是在基础的外植体粘附法上进行方案的改进，从而更加简单高效的建立原代成纤维细胞的获取及培养。本发明不存在解离法对细胞造成的损伤影响活力，同时培养条件的改进，克服了从组织块中获取细胞的困难，以及提高了低密度细胞增殖的效率，高效缩短皮下注射自体成纤维细胞的周期。

技术领域

本发明涉及一种利用外植体粘附法在体外快速增殖自体成纤维细胞的方法，属于细胞培养领域。

背景技术

衰老不可抗拒，没有谁能永葆青春。随着年龄的增长，活力幼嫩的细胞便会失去水分、体积变小不再饱满，新陈代谢速率逐渐减慢，细胞逐步的自然衰老直至凋亡。另一方面体内干细胞的衰退，使得产生的新细胞在数量上完全无法全部替换下衰老凋亡的的老细胞，致使身体有效细胞数量下降，皮肤出现弹力纤维、胶原纤维的变性，皮肤萎缩、变薄、色素沉着青春不葆。

随着社会经济的增长，医疗美容行业日益增长，而面部修复在医美行业中占首要地位，越来越多的人选择通过医疗手段干预皮肤的衰老。目前医美行业对面部老化治疗之一的手段是通过皮肤导入生物制剂胶原蛋白、透明质酸酶等替代皮肤真皮层中衰老细胞减少的细胞外基质成分，达到填充除皱的效果。不可否认这种手段起效快作用明显，但在生物代谢的作用下这些成分降解也快，治疗效果不持久。同时这种非自体成分的导入容易导致机体的排异，产生过敏反应。

皮肤由表皮和真皮层组成，而真皮层中存在的成纤维细胞是细胞外基质的重要分泌来源。其分泌的胶原蛋白的多少影响着皮肤的厚度、弹性、光泽度等。然而随着年老，真皮层中的成纤维细胞及其分泌的胶原蛋白不断减少，导致无法维系皮肤正常的结构和生理功能。因此补充皮肤成纤维细胞的数量，促进胶原蛋白的分泌，成为皮肤除皱和治疗凹陷性瘢痕的可靠手段。同时与其他来源相比，人体皮肤组织易于获取，并且在道德上的争议和排斥问题更少，因此，从皮肤组织分离的人成纤维细胞是用于未来临床应用的方便材料。

发明内容

本发明提供一种外植体粘附法高效提取增殖自体成纤维细胞的方法，运用“组织工程技术”对皮肤组织进行分离、纯化、培养、扩增、并收获制成成纤维前体细胞注射液导入受术者皮肤真皮层。自体成纤维细胞不存在排异状况，可很好的在受术者真皮层组织中进行生长，从而替换自身老化的成纤维细胞不断的分泌胶原蛋白、弹性纤维等细胞外基质，促使真皮的厚度增加，恢复皮肤的弹性及光泽度。亦可通过针对性的导入到凹痕性瘢痕的受损皮肤处的真皮层，成纤维细胞除了分泌细胞外基质分子，还产生复杂的细胞生长因子，有促进伤口愈合祛疤的功效。

外植体粘附法和解离法是目前从组织中获取成纤维细胞最基础的方法，然而，皮肤组织多取自受术者耳后、眼睑等部位，皮肤大小有限，有限皮肤在组织解离法提取过程中极易造成酶的过度消化，降低细胞的活力，影响后续细胞的生长状态。本发明是在基础的外植体粘附法上进行方案的改进，从而更加简单高效的建立原代成纤维细胞的获取及培养。

为解决上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种成纤维细胞提取方法，其创新点在于：具体步骤如下：

（1）皮肤及外周血获取：取已经采集好的2周内未服用过阿司匹林及其他抗血小板及抗凝血作用的任何相关药物且无系统性疾病、无传染病和性病的健康者耳后或眼睑0.25cm²～1cm²皮块及外周血40ml～60ml；

（2）富含血小板血浆（PRP）提取：外周血经离心后得到的血小板血浆浓缩物；获取的外周血在22-24℃保存下6小时内进行PRP提取后添加终浓度5-10wt.%DMSO冷冻保护剂保存于-80℃，使用前按CaCl₂溶液：血小板血浆的体积比1:9加入8-12wt.%CaCl₂溶液激活后添加到DMEM/F12培养基，使其终浓度为1.0～3.0×10¹²plt/L；PRP是一种自体安全血液制品，富含血小板、白细胞、类胰岛素生长因子（IGF）等，这些都是成纤维细胞的基础扩散剂，有益于成纤维细胞的快速增殖；