[发明专利]一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒及提取方法

说明书

本发明公开了一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒及提取方法，具体涉及核酸提取技术领域，所述试剂盒包括蛋白酶处理液、裂解液、纳米磁珠、洗涤液和洗脱液；提取方法为：利用生理盐水和蛋白酶处理液处理离心的样本；加入裂解液、异丙醇和纳米磁珠震荡后静置；采用纳米磁珠多次吸附核酸；最后干燥、水浴洗脱即得病原体核酸。本发明提取纯化步骤简单、操作过程安全便捷、病原体核酸含量高，纯度高，通过简单的操作步骤得到高纯度、高浓度的病原体核酸，方便研究人员进行后续的检测。

技术领域

本发明实施例涉及核酸提取技术领域，具体涉及一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒及提取方法。

背景技术

口腔由于呼吸和进食，会存留大量种类繁多的细菌。正常人咽峡部培养应有口腔正常菌群，而无致病菌生长。但在机体全身或局部抵抗力下降和其他外部因素下可以出现感染等而导致疾病，如呼吸道感染、流感等。因此，咽拭子分泌物中病原体(细菌、病毒、衣原体等)的检测，是临床上重要的诊断手段。

目前病原体核酸提取纯化的方法有很多种，如离心柱法和磁珠法。这些方法各有优缺点，但都应考虑以下原则：将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净；排除有机溶剂和金属离子的污染。基于纳米磁珠的提取技术是利用亲水性纳米磁珠特异性地吸附样品溶液中的核酸，在外加磁场的作用将吸附的核酸-磁珠复合物从样品溶液中分离，通过洗涤液洗涤去除溶液中的蛋白和盐离子，最后在仅留有特异吸附核酸的磁珠中加入洗脱液，将核酸释放于洗脱液中。磁珠法提取病原体核酸与离心柱法相比，操作简单，不易污染，已经成为目前分子生物学和临床检验医学研究的理想方法。

但是现有纳米磁珠提取技术还存在以下不足：提取纯化步骤较多，操作繁琐，所得病原体核酸含量底，且纯度不高，不能够直接用于后续检测。

发明内容

为此，本发明实施例提供一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒及提取方法，提取纯化步骤少，操作简便，整个过程不涉及有毒试剂，安全便捷，所得病原体核酸含量高，纯度高，可直接用于后续检测，以解决现有技术中存在的问题。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒，所述试剂盒包括蛋白酶处理液、裂解液、纳米磁珠、洗涤液和洗脱液；

本发明还提供了一种咽拭子样本中病原体核酸的提取方法，包括如下步骤：

步骤S1：取一新鲜咽拭子样本于1.5ml离心管中，使用无菌移液枪头向该离心管中加入300ul生理盐水和10-40ul蛋白酶处理液，震荡混匀1min， 56℃水浴静置10min；

步骤S2：取50-200ul步骤S1中的样本处理液于1.5ml离心管中，使用无菌移液枪头向该离心管中加入75-300ul裂解液、75-300ul异丙醇和纳米磁珠5-20ul，震荡混匀1min，室温静置10min；

步骤S3：将步骤S2中的离心管置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸弃上清溶液；

步骤S4：使用无菌移液枪头向步骤S3离心管中加入300-800ul洗涤液，将该离心管震荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸弃上清溶液；

步骤S5：重复步骤S4一次；

步骤S6：室温开盖干燥5-20min直至管内无液体残留；

步骤S7：使用无菌移液枪头向步骤S6离心管中加入100-200ul洗脱液， 56℃水浴5-10min；

步骤S8：将步骤S7离心管震荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸取上清至新的离心管，即获得样本中的病原体核酸。

进一步地，步骤S1中所述的蛋白酶处理液浓度为10-200mg/ml。