[发明专利]一种矾根丛生芽超低温保存及恢复培养方法

权利要求书

1.一种矾根丛生芽的超低温保存方法，其特征在于，所述方法由如下步骤组成：

S1、无菌系的建立与增殖：矾根茎基部组织经消毒后，接种在含6-BA 2.0mg/L、NAA0.1mg/L的MS培养基上，20-40d后形成丛生芽；将丛生芽分割成单芽，转接于含6-BA 0.1mg/L的MS培养基上进行增殖培养；

S2、叶片丛生芽诱导：取4-7mm的无菌组培苗叶片，背面向上放入含6-BA 2.0mg/L，NAA0.1mg/L的MS培养基中，15-30天诱导出0.5-1.5mm的丛生芽；

S3、丛生芽预培养：将丛生芽带叶基盘转入含蔗糖的MS培养基培养1-3天；所述含蔗糖的MS培养基中含蔗糖0.3mol/L；

S4、丛生芽的机械固定:用镊子将带丛生芽的叶基盘串连到灭菌过的12-15mm大头针上,每根针串连3-8片叶基盘，组成叶基盘串；

S5、丛生芽装载及玻璃化处理：将丛生芽叶基盘串放于预处理溶液中装载1hr后转入玻璃化保护剂PVS2中进行20-60分钟的冰浴处理；所述预处理溶液为MS培养基+1.2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖；

S6、冷冻：将丛生芽叶基盘串迅速投入液氮中冻存。

2.根据权利要求1所述的矾根丛生芽的超低温保存方法，其特征在于，步骤S1中，增殖培养的培养温度24±2℃，光照强度为30-35μmol·m^-2·s^-1，光照时间为10-12h/d，每20-40d继代1次。

3.一种采用如权利要求1所述方法超低温保存后的矾根丛生芽的恢复培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

A1、解冻洗涤：取出冻存的丛生芽叶基盘串，在35-40℃水浴中解冻60-90S后在1.2M蔗糖MS液体培养基洗涤15-20分钟；

A2、恢复培养：用镊子将带丛生芽的叶基盘由叶基盘串分离，在无菌滤纸上吸干，并在体视显微镜下逐一将丛生芽与叶片基部组织剥离，将丛生芽接种到恢复培养基上，黑暗培养7天后转到正常光照培养。

4.根据权利要求3所述的恢复培养方法，其特征在于，步骤A1中，所述1.2M蔗糖液体培养基为1/2MS培养基+1.2mol/L蔗糖。

5.根据权利要求3所述的恢复培养方法，其特征在于，步骤A2中，所述恢复培养基为1/2MS培养基+6-BA 2mg/L+NAA 0.1mg/L+GA₃0.5mg/L。

6.根据权利要求3所述的恢复培养方法，其特征在于，步骤A2中，所述黑暗培养的参数为培养温度24±2℃，光照强度为0μmol·m^-2·s^-1；所述光照培养的参数为培养温度24±2℃，光照强度为30-35μmol·m^-2·s^-1，光照时间为12h/d。