[发明专利]一种矾根丛生芽超低温保存及恢复培养方法

说明书

本发明公开了一种矾根丛生芽超低温保存及恢复培养方法；包括如下步骤：1.无菌苗体系建立；2.叶片丛生芽的诱导；3.丛生芽的预培养；4.丛生芽的机械固定；5.丛生芽的装载及玻璃化的处理；6.冷冻及解冻洗涤；7.恢复培养。本发明首次提出对矾根叶片诱导丛生芽成功进行超低温保存，保存后矾根恢复生长状况良好。本发明将丛生芽带叶基盘整体作为冻存材料，省去了茎尖剥取的繁琐技术手段，并通过机械固定批量处理，进一步简化操作步骤，最终得到矾根的再生植株；因此，对建立便捷稳定高效的矾根超低温保存体系，有利于矾根属资源规模保存，构建资源库，具有很好的参考价值。

技术领域

本发明属植物细胞工程技术领域；涉及一种矾根丛生芽超低温保存及恢复培养方法，尤其涉及一种矾根叶片诱导丛生芽的超低温保存及再生植株的方法。

背景技术

矾根(Heuchera micrantha)为虎耳草科矾根属多年生彩叶草本花卉，因其叶色多彩常绿及具有耐寒、耐阴、抗旱、耐盐碱等特点，在园林中应用广泛，具有良好的发展前景。矾根属有40多个种及许多园艺杂交品种，其种质资源有效保存对于培育具有自主知识产权的新品种十分重要。矾根常规的繁殖方法为播种、分株，大多数矾根品种结实困难，有性繁殖的方法不能保持矾根原有的品种特性；分株繁殖系数极低，无法规模化生产；在圃地保存不但费时费工，且容易受到自然灾害影响造成种质流失。

植物组织与细胞的培养为植物的种质保存开辟了新的途径。组织培养物能迅速大量繁殖,再生植株可保持原有的遗传特性。近几年科研人员加大了对矾根组织培养技术的研究，但组培繁殖成本较高，过程繁琐，周期较长，亟需建立更有较的保存方法。超低温保存(-196℃)下，植物的生物化学活性近乎停止，贮藏过程中的生理和遗传变化能够控制在最低限度内，避免了田间保存易受自然灾害影响而导致种质变异或毁灭，以及组织培养保存中因多次继代引起遗传性状变异或污染的危险，被认为是植物遗传资源长期保存的最优选择。关于植物超低温保存的研究，保存技术的多样化与简易化方面不断取得进步，能够保存的植物物种数也在不断地增长，但多数集中在苹果、樱桃、柑桔、香蕉、木薯等木本植物以及马铃薯、红薯、草莓等经济植物为主的植物遗传资源的超低温保存。目前未见矾根超低温保存的报道。茎尖组织由于遗传稳定性好，一般作为超低温保存冻存材料，但由于茎尖组织较小且幼嫩，对工作人员的技术水平要求较高，在剥取及其后冻存的操作过程中容易受到机械损伤，影响成活率。本发明将丛生芽带叶片基部组织整体作为冻存材料，省去了茎尖剥取的繁琐技术手段，并通过现成易获得的大头针作为固定物，利用材料本身进行机械固定批量处理，进一步简化操作步骤，最终得到矾根的再生植株；因此，对建立便捷稳定高效的矾根超低温保存体系，有利于矾根属资源规模保存，构建资源库，具有很好的参考价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种矾根丛生芽的超低温保存方法,同时还提供一种矾根丛生芽的超低温保存后的恢复培养方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种矾根丛生芽的超低温保存方法，所述方法包括如下步骤：

S1、无菌系的建立与增殖：矾根茎基部组织经消毒后，接种在含BA及NAA的MS培养基上，20-40d后形成丛生芽；将丛生芽分割成单芽，转接于含BA的MS培养基上进行增殖培养；

S2、叶片丛生芽诱导：取4-7mm的无菌组培苗叶片，背面向上放入含BA及NAA的MS培养基中，15-30天诱导出0.5-1.5mm的丛生芽；

S3、丛生芽预培养：将丛生芽带叶基盘转入含蔗糖的MS培养基培养1-3天；

S4、丛生芽的机械固定:用镊子将带丛生芽的叶基盘串连到灭菌过的12-15mm大头针上,每根针串连3-8片叶基盘，组成叶基盘串；

S5、丛生芽装载及玻璃化处理：将丛生芽叶基盘串放于预处理溶液中装载1hr后转入玻璃化保护剂PVS2中进行20-60分钟的冰浴处理。

S6、冷冻：将丛生芽叶基盘串迅速投入液氮中冻存。