[发明专利]一种纳米抗体人源化的方法

说明书

本发明公开一种纳米抗体人源化的方法，本方法利用带有回复突变位点的引物之间的重叠序列搭桥进行重叠PCR，以实现扩增人源化可变区全长突变文库序列，构建抗体人源化回复突变文库，随后进行表达并筛选出高亲和力分子。这种方法操作简单，并尽可能多将所有突变组合在文库里，以利后续对文库的突变体进行筛选，保留经过筛选且合适的人源序列，降低免疫反应，又能够最大限度的保留其特异性和亲和力，从而达到合理的人源化的效果。

技术领域

本发明涉及分子生物学中抗体人源化设计研究领域，包括分子生物学，生物化学，抗体蛋白结构预测和模拟，具体涉及一种利用带有点回复突变位点的引物的相互重叠区域搭桥的PCR进行纳米抗体人源化回复突变文库建立的方法。

背景技术

最早用于单克隆抗体人源化改造的方法是构建嵌合抗体^[1]。该方法是将鼠源抗体的可变区和人抗体恒定区通过基因工程技术连接起来，即将鼠源抗体的恒定区基因替换为人抗体恒定区基因，与抗原结合的可变区部分仍然是鼠源抗体。此方法构建出的工程化嵌合抗体最大限度的保留了识别靶抗原能力的鼠源抗体可变区，同时又拥有了人抗体所有的恒定区的免疫学杀伤效应，而且由于这种嵌合抗体的免疫原性相比原始的鼠源抗体降低了2/3，所以可以应用于人体治疗^[2]。但由于其分子中还保留1/3的鼠源部分,用于长期临床治疗还有可能发生人抗鼠抗体反应。因此，为了进一步降低嵌合抗体的免疫原性，需要对嵌合抗体的鼠源可变区进行进一步的人源化改造，获得全人源化抗体。

目前应用较多的全人源化方法是将鼠源抗体可变区内参与抗原结合的部分与选择用于做模板的人抗体可变区的框架区重新拼接，使抗体可变区中除高度可变的互补决定区(CDR)来源于鼠抗体外，其余部分都换成人源的。由于抗体可变区中参与抗原结合的一般是其6个互补决定区(CDR)，故此过程也被称为“特异性和亲和力”。为了克服由于“CDR移植”可能导致的亲和力下降，需通过一系列对框架区残基的突变，逐步恢复或提高抗体的抗原结合能力，从而得到人源化程度更高的重构抗体^[3-5]。已报道的构建重构抗体的方法依照其人源化改造使用的模板的选择和回复抗体结合能力的方法，目前主要的方法是通过序列对比，以序列相似性为标准分别选择相似性最高的抗体轻链和重链可变区的人源抗体为模板序列，在经过CDR移植后的轻、重链序列基础上，针对可能影响结合能力的框架残基分别构建一系列突变体，鉴别合适的突变组合。由于这些突变体需各自独立制备及测试其抗原结合能力，然后将较好的突变组合起来，即需要对各个可能的残基的突变、筛选重复循环实验，所以步骤繁复，效率低，费时费力。

相关参考文献：

[1]Vaughan TJ,OsbournJK,Tempest PR.(1998)Human antibodies bydesign.Nat.Biotechnol 6:535-539

[2]Davis TA.(1999)Final reporton the saiety and elficacy ofretreatment with rituximab lor patients withnon-Hodgkin’s lymphoma.Blood 94:88a

[3]JonesPT,Dear PH,Foote J.(1986)Replacing the complementarity-determining regions ina human antibody with those from a mouse

[4]Riechmann L,Clark M,Waldmann H.(1988)Reshaping human antibodiesfor therapy

[5]Chothia C,Lesk AM,Tramontano.(1989)Conformations of immunoglobulinhypervariable regions

发明内容