[发明专利]一种肝脏类器官、其快速构建的方法及其应用

权利要求书

1.一种肝脏类器官快速构建的方法，其特征在于，包括如下步骤：分别取原代肝细胞单细胞悬液、间充质干细胞单细胞悬液和肝非实质细胞单细胞悬液，按活细胞数比为4:0:(0.125-4)或者4:1:(0.125-4)、且细胞密度为0.5×10⁵/cm²-2.5×10⁵/cm²混合均匀后，加入到非组织培养处理的培养板或者超低贴壁性能培养板中，再置于5％v/v CO₂、37℃的培养箱中，培养24h±2h，即得到肝脏类器官。

2.根据权利要求1所述的肝脏类器官快速构建的方法，其特征在于，所述原代肝细胞单细胞悬液由如下方法制备得到：取冻存的原代肝细胞，于37℃迅速解冻，加入到10倍体积的、37℃预热的复苏培养基中，颠倒混匀后，静置30min-45min，离心并去掉上清，加入铺板培养基，即得到原代肝细胞单细胞悬液。

3.根据权利要求2所述的肝脏类器官快速构建的方法，其特征在于，所述复苏培养基是在MEM培养基中添加以下成分：1％v/v的ITS通用型培养添加剂、2mmol/L的L-谷氨酰胺、10μg/L的表皮生长因子、18mg/L的氢化可的松、40μg/L的地塞米松、1％v/v的青链霉素、10％v/v的胎牛血清和2％m/v-4％m/v的牛血清白蛋白；所述铺板培养基是在William′s E培养基中添加以下成分：1％v/v的ITS通用型培养添加剂、2mmol/L的L-谷氨酰胺、10μg/L的表皮生长因子、18mg/L的氢化可的松、40μg/L的地塞米松、1％v/v的青链霉素和5％v/v的胎牛血清。

4.根据权利要求1所述的肝脏类器官快速构建的方法，其特征在于，所述间充质干细胞单细胞悬液由如下方法制备得到：取原代间充质干细胞，按4500个活细胞/cm²-5500个活细胞/cm²接种到组织培养处理过的培养板中，在间充质干细胞扩增培养基中进行扩增培养，待细胞融合度为75％-85％时，胰酶消化，即得到间充质干细胞单细胞悬液。

5.根据权利要求4所述的肝脏类器官快速构建的方法，其特征在于，所述原代间充质干细胞为人脐带间充质干细胞、人骨髓间充质干细胞和人脂肪间充质干细胞中的任意一种；所述间充质干细胞扩增培养基是在α-MEM基础培养基中添加15％v/v的胎牛血清和1％v/v的青链霉素；所述胰酶消化在10代以内，分别得到第1代至第10代的间充质干细胞单细胞悬液。

6.根据权利要求1所述的肝脏类器官快速构建的方法，其特征在于，所述肝非实质细胞单细胞悬液由如下方法制备得到：取原代肝非实质细胞，以0.5×10⁵/cm²的密度接种到组织培养处理过的培养板中，待细胞融合度为75％-85％时，胰酶消化，即得到肝非实质细胞单细胞悬液。

7.根据权利要求6所述的肝脏类器官快速构建的方法，其特征在于，所述胰酶消化在5代以内，分别得到第1代至第5代的肝非实质细胞单细胞悬液。

8.一种如权利要求1-7任一项所述的构建方法构建得到的肝脏类器官。

9.根据权利要求8所述的肝脏类器官，其特征在于，所述肝脏类器官具有以下特征中的一种或多种：(a)具有的细胞密度为500-5000个细胞/个类器官；(b)类器官呈球形，实心，直径150μm-750μm,相当于5-30层细胞的厚度；(c)细胞在三维空间相互接触；(d)显示肝脏组织固有的功能。

10.一种如权利要求8所述的肝脏类器官在药物代谢、药物毒性和毒理研究；参与肝脏损伤和修复的机制研究；肝脏的炎症性和传染性疾病的研究；生物人工肝以及致病机制的研究中的应用。