[发明专利]一种肝脏类器官、其快速构建的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种肝脏类器官、其快速构建的方法及其应用，属于类器官的构建技术领域。所述肝脏类器官快速构建的方法，包括如下步骤：分别取原代肝细胞单细胞悬液、间充质干细胞单细胞悬液和肝非实质细胞单细胞悬液，按活细胞数比为4:0:(0.125‑4)或者4:1:(0.125‑4)、且细胞密度为0.5×10⁵/cm²‑2.5×10⁵/cm²混合均匀后，加入到非组织培养处理过的培养板或者超低贴壁性能培养板中，再置于5％v/v CO₂、37℃的培养箱中，培养24h±2h，即得到肝脏类器官。本发明构建得到的肝类器官可广泛应用于病毒研究、细胞研究、药物毒性研究、代谢研究和生物人工肝等领域。

技术领域

本发明涉及一种肝脏类器官、其快速构建的方法及其应用，属于类器官的构建技术领域。

背景技术

原代肝细胞是指从肝组织取出后立即培养的肝细胞，可用于肝脏基础研究、病毒研究、药物研发、肝细胞移植以及肝脏器官3D打印。通常情况下，原代肝细胞的培养与维持是在二维(2D)培养体系下进行，即在培养板上包被I型鼠尾胶原，按照严格的细胞密度，将肝细胞接种胶原包被板上，通过加有DMSO的维持培养基进行肝细胞维持。然而，2D培养条件下的肝细胞，许多重要的细胞或者生理功能在很短的时间内丢失，不利于细胞研究和药物研究。在体内，肝细胞与其它肝非实质细胞和细胞外基质相互接触，存在多种细胞间的交流形式，以实现多种重要的细胞功能。

3D细胞培养是能在细胞培养过程中为细胞提供一个更加接近体内生存条件的微环境的培养技术，形成具有3D结构的混合细胞组织或者细胞团，广泛应用于病毒研究、细胞研究、药物毒性和代谢研究等。

目前，构建肝脏类器官的方法相对较多，主要有四种，各有优缺点：

一是基于细胞外基质形成“三明治”结构，即利用I型胶原在不同PH下的溶解度不一样，首先铺底层胶原层，接着铺肝细胞，最后在肝细胞上铺上层胶原，形成“三明治”结构，重现肝细胞在体内与细胞外基质的相互作用，让肝细胞生活在三维结构中，相对于2D培养，能更好维持肝细胞的特性。由于“三明治”结构仅实现肝细胞与细胞外基质的相互作用，是相对低级的3D培养方式。

二是基于3D打印技术的类器官构建方法，细胞可以按照预设程序进行排列，得到结构一致的肝脏类器官。缺点是依赖昂贵的3D打印机，产量有限，不利于肝脏类器官的大规模应用。

三是基于微流控技术的肝脏芯片，利用定制化、具有特殊结构的芯片，将肝细胞、肝非实质细胞接种到特定腔室里，实现肝细胞与肝非实质相互作用，以及培养废物的及时排除。但该技术依赖昂贵的仪器设备，技术要求高、产量有限，不利于肝脏芯片的大规模应用。

四是基于细胞自成团的细胞培养技术，主要是利用可贴壁培养的(冻存)肝细胞特性，在低贴壁的培养板上，经过5-7天的悬浮培养，肝细胞自发组织成团，形成圆球体。此方法优点是成本低，简单易行，是目前3D培养技术主要方式；缺点是仅可贴壁肝细胞才能成团、成团时间长(5-7天)，成功率相对较低(仅65％)。

鉴于此，有必要开发一种成本低、快速、高效的肝脏的类器官快速构建的方法。

发明内容

本发明的目的之一，是提供一种肝脏类器官快速构建的方法。本发明的肝脏类器官快速构建的方法，一是能实现原代肝细胞和肝非实质细胞的快速成团(24h以内)，成功率高(100％)；二是不仅可以实现贴壁原代肝细胞的高效成团，还可以实现非贴壁原代肝细胞的高效成团。本发明构建得到的肝类器官可广泛应用于病毒研究、细胞研究、药物毒性、代谢研究和生物人工肝等领域。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种肝脏类器官快速构建的方法，包括如下步骤：