[发明专利]一种基于CRISPR-Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法

权利要求书

1.一种基于CRISPR-Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将不同浓度待检测的靶基因、PAMmer、Cas9与sgRNA以适当比例混合于缓冲溶液中，并于37℃条件下孵育30～60min，得到点特异性切割产物；所述靶基因为ssRNA或ssDNA，所述PAMmer与待测靶基因相匹配，所述sgRNA包括锚定序列和引导区序列，所述锚定序列与Cas9蛋白特异性识别，所述引导区序列与所述靶基因的片段相匹配；

2）将步骤1）中得到的点特异性切割产物加入到EXPAR反应体系中进行指数扩增反应，经phi29 DNA聚合酶延伸和Nb.BbvCI选择内切酶切割，得到富G序列的扩增产物；

3）向步骤2）得到的富G序列的扩增产物中加入含K⁺缓冲液和hemin溶液充分反应，再加入过量的ABTS和H₂O₂孵育5min，用紫外可见分光光度计检测反应体系的紫外可见光的吸收强度；

4）根据不同浓度靶基因的标准溶液做靶基因浓度-紫外可见光的吸收强度的标准曲线，计算回归方程，再根据待测溶液的紫外可见光的吸收强度，计算待测溶液中靶基因的浓度。

2.根据权利要求1所述基于CRISPR-Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法，其特征在于，所述的sgRNA是通过部分互补的两条DNA单链重叠延伸获得转录模板，再将所述转录模板进行转录得到。

3.根据权利要求2所述基于CRISPR-Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法，其特征在于，所述重叠延伸的程序：95℃×3 min；30个热循环：95℃×20 s，52℃×30s，72℃×25 s；72℃×10 min。

4.根据权利要求1所述基于CRISPR-Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法，其特征在于，步骤1）中所述PAMmer、Cas9与sgRNA的摩尔比为1:1:1。

5.根据权利要求1所述基于CRISPR-Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法，其特征在于，步骤1）中所述待检测的靶基因在反应体系中的终浓度为100aM~2.5nM。

6.根据权利要求1所述基于CRISPR-Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法，其特征在于，步骤2）中所述EXPAR反应体系包括0.3U/μL phi29DNA聚合酶，0.4U/μLNb.BbvCI，1×DNA聚合酶缓冲液，1×CutSmart缓冲液，0.5 mM dNTP和10 nM EXPAR模板；扩增反应温度为30~45℃，反应时间为1~2 h；所述点特异性切割产物作为引物与EXPAR模板相匹配，并延伸合成双链DNA。

7.根据权利要求6所述基于CRISPR-Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法，其特征在于，所述phi29DNA聚合酶还可以是Klenow Fragment(exo-) DNA聚合酶或vent(exo-) DNA聚合酶。

8.根据权利要求1所述基于CRISPR-Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法，其特征在于，步骤3）中所述反应温度为30~45℃，反应时间为10~40min。

9.根据权利要求1所述基于CRISPR-Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法，其特征在于，步骤3）中所述吸收强度为420 nm处的紫外吸收信号，检测范围400nm~460nm。

10.如权利要求1~9任一项所示方法在检测ssRNA或ssDNA单碱基突变中的应用。