[发明专利]一种基于CRISPR-Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法，该方法通过CRISPR/Cas9的可编程切口功能实现ssRNA和ssDNA的点特异性切割，以产生所需要的单链DNA片段，该片段在3'端具有特定的序列，可以用作引物来激发EXPAR进行指数扩增，从而实现对不同靶标序列ssRNA和ssDNA可视化检测。本发明具有成本低，操作简便，效率高，灵敏度高和特异性强，结果读取简单，减少了对热循环仪器和精密信号采集仪器的依赖。为单链核苷酸的检测提供了新思路和新选择，也将在临床诊断和生物医学研究中发挥关键作用，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物医学监测技术领域，尤其涉及一种基于CRISPR-Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法。

背景技术

对于大多数RNA病毒而言，以单链RNA(ssRNA)的形式感染生物，部分DNA病毒以单链DNA(ssDNA)形式进行复制。此外，人体中许多RNA以单链形式存在以执行其特定功能。因此，快速准确检测单链特异性核酸在疾病诊断和病理分析中起着至关重要的作用。同时核酸序列中的单碱基改变，是构成细菌、病毒以及肿瘤抗药性的遗传学基础，同时也和多种疾病有密切关系。所以快速准确的检测出核酸序列中的单碱基改变，同样对生物研究与疾病诊断都将具有重要的作用。

目前，关于核酸的检测方法研究者们已开发了如基于核酸聚合酶、核酸水解酶、脱氧核酶和纳米材料等的多种核酸信号放大技术。比如，目前最多的是基于聚合酶链式反应(PCR)的信号放大技术，即在PCR体系中加入分子信标，通过分子信标与PCR产物的结合来释放荧光，这种方法不仅需要精密的变温控制仪器并且对单链寡核苷酸的检测有一定局限性。研究者们还开发了一种基于核糖核酸酶H(RNaseH)的单循环核酸信号放大技术，即通过环部带有RNA序列的分子信标与目标DNA杂交，在RNaseH的作用下将分子信标的RNA部分水解，从而释放荧光基团。虽然这种技术的目标序列可以为单链寡核苷酸，但由于其为单循环线性信号放大技术，信号放大效率较低从而一定时间内产生的信号强度不足，导致检测灵敏度较低。从而限制了上述方法在实际中的应用范围。

近几年发展起来的恒温扩增技术是用于核酸检测最常用于信号放大的方法，无论是在实际操作还是仪器要求方面，都比PCR技术更为简单方便，它摆脱了对精良设备的依赖，在临床和现场快速诊断中显示了其良好的应用前景，包括滚环扩增(RCA)、催化发夹装配技术(CHA)、杂交链式反应(HCR)、链置换扩增(SDA)和EXPAR。其中，RCA方法涉及繁琐的DNA探针连接过程和引物-模板比例的调整，熵变化驱动的CHA和HCR扩增效率低，且容易引起背景干扰。EXPAR和SDA的高扩增效率使其成为有效的核酸检测扩增策略。然而，ssRNA和ssDNA具有较长的核苷酸序列和不确定的3'末端，这使得ssRNA和ssDNA不能直接用作引发扩增反应的引物。因此，建立用于测量ssRNA和ssDNA的准确而有效的策略仍然是一项极富挑战性的任务。

CRISPR/Cas系统是目前发现存在于大多数细菌与所有古细菌中的一种免疫系统，用于抵抗外源物质的入侵。CRISPR(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)是成簇的规律间隔的短回文重复序列，该系统通过对入侵的病毒核酸进行特异性的识别，利用CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)切割外源核酸从而达到防御的目的。近年来，CRISPR/Cas系统作为一种基因工程中非常重要的工具被广泛应用于基因编辑、基因表达调控及基因检测等研究中。

发明内容

针对上述现有检测技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于CRISPR-Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法，旨在解决传统长链ssRNA或ssDNA检测成本高、对热循环设备依赖性、要求检测人员具有较深的专业知识等问题，以及ssRNA和ssDNA具有较长的核苷酸序列和不确定的3'末端，不能直接应用于链置换扩增(SDA)、EXPAR等恒温扩增技术的问题，使ssRNA和ssDNA现场可视化检测成为可能。