[发明专利]一株高效抑制金黄色葡萄球菌的解淀粉芽胞杆菌工程菌

说明书

本发明提供了一株高效抑制金黄色葡萄球菌的解淀粉芽胞杆菌工程菌，通过基因工程的方法敲除了解淀粉芽胞杆菌HZ‑12的基因组内表面活性素Surfactin合成相关基因srfAC基因，成功得到了缺失srfAC基因的解淀粉芽胞杆菌HZΔsrfAC，显著提高了解淀粉芽胞杆菌对金黄色葡萄球菌的抑菌活性。相对于解淀粉芽胞杆菌HZ‑12来说，本发明所构得的工程菌株对金黄色葡萄球菌的抑制效果提高了64%。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其是一株高效抑制金黄色葡萄球菌的解淀粉芽胞杆菌工程菌。

背景技术

金黄色葡萄球菌是最主要的食源性致病菌之一，常导致食物中毒，严重危害人类健康，且抗生素的大量使用导致金黄色葡萄球菌的耐药性逐年增加。采用可抑制金黄色葡萄球菌的益生菌是解决其耐药性的有效手段。芽胞杆菌作为一类具有广谱抑菌活性的益生菌，在抑制金黄色葡萄球菌的应用中具有极大的开发潜力。

解淀粉芽胞杆菌HZ-12对金黄色葡萄球菌具有抑制作用。解淀粉芽胞杆菌可分泌多种抑制细菌、真菌的物质，其中表面活性素(Surfactin)是最强大的生物表面活性素之一，已被证明对真菌具有良好的抑制作用，可破坏真菌病原体的磷脂膜稳定性，从而导致细胞溶解，但对细菌不敏感。Surfactin的生物合成基因簇由4个合成基因组成，其中srfAA、srfAB和srfAC编码非核糖体肽合成酶，尤其是srfAC基因在Surfactin的合成中至关重要。一方面，Surfactin作为表面活性剂可导致液体发酵产泡，可能会影响菌体的新陈代谢。另一方面Surfactin合成途径复杂，其合成过程会消耗大量的能量，可能减少其他代谢物的产生。而且，Surfactin还可影响芽胞杆菌的运动性及其生物膜的形成。由此推断，阻断Surfactin可能会降低其对解淀粉芽胞杆菌产生细菌抑制物质的影响，有待进一步研究。本发明首次发现：通过敲除解淀粉芽胞杆菌HZ-12的srfAC基因，阻断Surfactin的合成，显著提高了其对金黄色葡萄球菌的抑制作用，并获得了一株可高效抑制金黄色葡萄球菌的工程菌。

发明内容

本发明的目的在于提供一株高效抑制金黄色葡萄球菌的解淀粉芽胞杆菌工程菌，通过基因敲除技术对表面活性素Surfactin合成相关基因srfAC进行敲除，使其对金黄色葡萄球菌的抑制作用显著提高。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

一株高效抑制金黄色葡萄球菌的解淀粉芽胞杆菌工程菌，所述工程菌是敲除解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HZ-12表面活性素合成基因srfAC所得，具体构建方法如下：

1)以解淀粉芽胞杆菌HZ-12的基因组DNA为模板，PCR扩增srfAC基因的上游同源臂和srfAC基因的下游同源臂；

2)通过重叠延伸PCR将srfAC基因的上游同源臂和srfAC基因的下游同源臂连接到一起，构成同源臂融合片段；

3)采用XbaI和BamHI限制性内切酶对同源臂融合片段和质粒T2(2)-ori进行双酶切，得到酶切基因片段和线性质粒片段，经DNA连接酶进行连接，得到敲除质粒T2(2)-ΔsrfAC；

4)将敲除质粒T2(2)-ΔsrfAC转入解淀粉芽胞杆菌HZ-12中，以卡那青霉素作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；

5)将阳性转化子在45℃条件下转接培养基数次后，进行菌落PCR检测，得到srfAC基因的上游同源臂或srfAC基因的下游同源臂与解淀粉芽胞杆菌HZ-12基因组DNA产生完全单交换的阳性单交换结合子菌株；

6)挑选阳性单交换结合子菌株接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养基，PCR法筛选得到敲除了srfAC基因的解淀粉芽胞杆菌HZΔsrfAC。